用。
[0012] 使用上述運動必率反應基因檢測試劑盒按如下步驟進行檢測： (1)提取樣本基因組DNA。
[0013] 采集該測試者唾液，向l-2ml唾液樣品中加入500ul提取緩沖溶液，該DNA提取 緩沖溶液溶劑為50mM的化is-肥1 pH7. 4、0. 5mM的邸TA和50mM的化C1，反復吹打混勻 后，8000Xg離必5分鐘，棄去上清，此步驟重復一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液， 該裂解液溶劑為 50mM Tris-肥 1 pH7. 4,50mM Tris-肥 1 pH7. 4，150mM 化Cl，lmM 邸TA，1% Triton χ-100，1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS,蛋白酶 K20mg/mL,徹底懸浮沉淀并 充分混勻后，室溫放置30分鐘，期間來回顛倒離必管數次；得到的混合液中，加入濃度為 lOmg/mLRNA酶的水溶液10 μ L，37°C下靜置lOmin ;得到的上清液中，加入等體積苯酪-氯 仿混合溶液，苯酪和氯仿體積比為1 : 1，充分混勻，混合液4°C，12000Xg離必5分鐘，上清 液移入干凈離必管內；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和異戊醇體積 比為25 : 24 : 1，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干凈離必管內；加 入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干 凈離必管內；加入0. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸鋼溶液，-2(TC靜 置60分鐘后，4°C，12000 X g離必10分鐘，棄上清液；得到的沉淀物中加入0. 5血70 %己醇 清洗沉淀物，4°C，12000 X g離必5分鐘，棄上清液，此步驟重復一次；得到的沉淀物自然風 干，加入20 μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，-2(TC保存。
[0014] (2)PCR 擴增 本實施例同時檢測 rs2979481、rs6432018、rs2253206、rsl560488、rsl0248479、 rs857838、rs909562、rs4759659和rs2057368。每個SNP的檢測需要一對上下游引物、兩條 多態引物共4條PCR引物，共需要36條引物。每個SNP的檢測需要做兩管PCR擴增，為防 止出現假陽性之類的反應，衡量PCR是否成功，加設一管陰性對照組，共做19管PCR，所述 陰性對照組基因組模板及反應體系是一樣的，但沒有引物存在。
[001引根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系： 2.5μ 110XPCR緩沖液，2μ 1 dNTPs，0.5u 1引物組，熱啟動Taq酶0. 15μ 1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0016] 將裝有反應溶液的化pendorf試管放入ΑΒΙ 9700 PCR儀中，設置反應條件如下： 預變性951：3111111;熱循環941：3〇3,6〇1：3〇3,721：3〇3,35個循環；延伸721：3111111。反應 結束后，取出試管。
[0017] 由于19管PCR擴增反應是在同一臺PCR儀上同步進行的，為了實現檢測的高 效性、特異性，要求36條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進行大量的DNA序列軟件分析 來設計PCR引物，并通過大量的實驗來進行Tm值的優化并確定設計的合理性，本試劑盒各 基因 SNP多態性的檢測是既相對獨立又相互聯系的，不可分割。
[001引（3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下；3g瓊脂糖，加入lOOmL去離子水，微 波爐加熱Imin，冷卻到6(TC時加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產 物10 μ L與6 X T邸緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結果并 拍照，所得瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0019] 檢測得到9個基因分型分析結果如下：
根據W上分型結果進行統計，純和的Common Allele記為2,純和的Minor Allele記為 0,而雜合型記為1，因此W上9個基因的分型結果總和等于：1+1+1+1+1巧+1+1巧=11。根據 對W上9高基因的綜合研究，如果總和小于等于9,則受測者的皿50不會隨著個體鍛煉周期 的累計而發生改變，如果總和大于等于16,則受測者的HR50在經過一段時間的鍛煉之后會 下降大約20bpm。而在該測試者來看，其總和介于9和16之間，其皿50會隨運動周期和強 度而降低，但降幅不超過20bpm。因此，如果有專業的健身教練指導時，該受測者應向教練表 明該測試結果。因為，對于教練來講，傳統經驗認為人體在經過一定時間的鍛煉之后，其必 率應該有一定程度的下降。如果沒有下降，教練會認為該鍛煉強度不夠，會刻意加大運動強 度或延長運動時間。送樣的做法是不科學的，而且刻意加大強度和時間會損害健身者的健 康。該測試結果提醒教練該個體在經過鍛煉后，必率會有下降，但皿50下降幅度不會超過 20bpm〇
[0020] W上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用W限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.心率反應基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，其特征在于：存放 的試劑包括： (1)針對9個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組（以下引物序列方向均為5'端至3' 立而）： 針對SNP rs2979481的引物組： 1 GCAACATACCAAGAGC 2 CAGACAGGATTCCA 3 CAGACCATGGTG 4 CGGGATGAGTCA 針對SNP rs6432018的引物組： 1 CCAAAAAGCAGTC 2 GGTATCTCCTTTGT 3 AATAGGTGCAATATT 4 GGCTGAGGCAGCA 針對SNP rs2253206的引物組： 1 GATAAGTTACAGTTAA 2 CATTCGCCTACC 3 CCCGGGACCACTCA 4 CTCTCCATCTGT 針對SNP rs 1560488的引物組： 1 GATAGTGTAAAAAACA 2 GTTTGTTCAGTCC 3 CTTTGCATATTAG 4 AGACTCACTAAAC 針對SNP rs 10248479的引物組： 1 GAACTGTGTGGAAACG 2 CTTTAGTGTAGAA 3 ATAAAGTTTAAATTC 4 ACGAGGAATGAG 針對SNP rs857838的引物組： 1 GGGACTGTCTATAA 2 AACATCTAATGAGG 3 ATGTTAGCCTAGC 4 AGATTAGCAAAC 針對SNP rs909562的引物組： 1 GCTTCACAAGCGGTTTC 2 GGACCTTGTTTGGA 3 GTCCTCAAAAGTAG 4 AGGATTGGAAAATGCACT 針對SNP rs4759659的引物組： 1 GGAGGGGGCGTAGCA 2 CAGAACTTGTACTC 3 CCTGTAATTCCAG 4 CACATTTTAAAATGG 針對SNP rs2057368的引物組： 1 AAACAAATTTTAAAAA 2 GTTTCAAGCAGGGGCTC 3 GTGGTAAAGTGGTGG 4 ATGTAAAATCCATT (2) PCR擴增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。2. 根據權利要求1所述的心率反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述引物用量均為 0· 5_1· Ο μ 1 〇3. 根據權利要求1所述的心率反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試劑 包括：10XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動Taq酶，基因組模板。4. 根據權利要求3所述的心率反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖液包 含：100mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。5. 根據權利要求3所述的心率反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試 劑用量為：10 XPCR緩沖液2. 5 μ 1，dNTPs2 μ 1，熱啟動Taq酶0. 1-0. 2 μ 1，基因組模板 50-100ng〇6. 根據權利要求1所述的心率反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠電 泳分析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、DNA無毒染料和DNA上樣緩沖 液。7. 根據權利要求6所述的心率反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA無毒染料 優選Biotium Gelred無毒染料。8. 根據權利要求1所述的心率反應基因檢測試劑盒，其特征在于：依據9個基因的分 型結果分別賦值(純和型common allele=2,雜合型=1，純和型minor allele=0)，然后進行 加成，依據所得總和值來分析受測者HR50隨運動周期和強度的變化。
【專利摘要】本發明提供了人體運動心率反應的基因檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，試劑包括：（1）針對9個基因SNP多態位點的PCR反應引物組（2）PCR擴增試劑（3）瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發明通過PCR引物的設計使多個PCR擴增反應可在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測的高效性、特異性，分析得到心率隨健身運動周期變化的基因基礎，從而為受測者獲得一個合適的運動方案，評估相應運動強度，采取相應的策略避免對其無效甚至是有害的方法。同時可以輔助專業教練員對運動員的訓練指導，評估運動員的訓練強度。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105671137
【申請號】
【發明人】李則軒, 范家成, 盧駿, 邱嘉銘, 別茜, 張靜靜, 朱軼凡, 張舒
【申請人】武漢白原科技有限公司, 湖北省體育科學研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年11月17日