入濃度為 lOmg/mLRNA酶的水溶液10 μ L，37°C下靜置lOmin ;得到的上清液中，加入等體積苯酪-氯 仿混合溶液，苯酪和氯仿體積比為1 : 1，充分混勻，混合液4°C，12000 X g離必5分鐘，上清 液移入干凈離必管內；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和異戊醇體積 比為25 : 24 : 1，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干凈離必管內；加 入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干 凈離必管內；加入0. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸鋼溶液，-2(TC靜 置60分鐘后，4°C，12000 X g離必10分鐘，棄上清液；得到的沉淀物中加入0. 5血70 %己醇 清洗沉淀物，4°C，12000 X g離必5分鐘，棄上清液，此步驟重復一次；得到的沉淀物自然風 干，加入20 μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，-2(TC保存。
[001 引（2)PCR 擴增 本實施例同時檢測RS16892496和RS7832552。每個SNP的檢測需要一對上下游引物、 兩條多態引物共4條PCR引物，共需要8條引物。每個SNP的檢測需要做兩管PCR擴增，為 防止出現假陽性之類的反應，衡量PCR是否成功，加設一管陰性對照組，共做5管PCR，所 述陰性對照組基因組模板及反應體系是一樣的，但沒有引物存在。
[0017] 根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系： 2.5μ 110XPCR緩沖液，2μ 1 dNTPs，0.5u 1引物組，熱啟動Taq酶0. 15μ 1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0018] 將裝有反應溶液的化pendorf試管放入ΑΒΙ 9700 PCR儀中，設置反應條件如下： 預變性951：3111111;熱循環941：3〇3,6〇1：3〇3,721：3〇3,35個循環；延伸721：3111111。反應 結束后，取出試管。
[001引由于5管PCR擴增反應是在同一臺PCR儀上同步進行的，為了實現檢測的高 效性、特異性，要求8條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進行大量的DNA序列軟件分析來 設計PCR引物，并通過大量的實驗來進行Tm值的優化并確定設計的合理性，本試劑盒各基 因 SNP多態性的檢測是既相對獨立又相互聯系的，不可分割。
[0020] (3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下；3g瓊脂糖，加入lOOmL去離子水，微 波爐加熱Imin，冷卻到6(TC時加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產 物10 μ L與6 X T邸緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結果并 拍照，所得瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0021] 檢測得到2個基因分型分析結果如下：
根據W上分型結果，該測試者的基因對瘦體重的貢獻值為;2. 7巧.55=5. 25KG。依據是 RS16892496 GG〉TG/TT GG 型的 LBM 比 TT 和 TG 型的多 2. 7KG，RS7832552 TT 型比 TC 和 CC 型的LBM多2. 55KG。送表明該測試者具有較高的肌肉組成，肌肉比重較高。
[0022] W上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用W限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 瘦體重基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，其特征在于：存放的 試劑包括： (1) 針對2個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組： 針對SNP RS16892496的引物組： 5, -GTTGAAGAGCAAGCCCCCA-3' 5' -GTGACTTGTACCCACG-3' 5' -GAACCAATAATACTCTCCTC-3' 5' -CATTTGGAATGGAAAC-3' 針對SNP RS7832552的引物組： 5' -GTGATAGTGTGAGGTAC-3' 5' -GTTTATTAAGAGCATTCA-3' 5' -ATCTTTAAAGAATTCTAG-3' 5' -TGCATTGGATTTTG-3' (2) PCR擴增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。2. 根據權利要求1所述的瘦體重基因檢測試劑盒，其特征在于：所述引物用量均為 0· 5_1· Ο u 1 〇3. 根據權利要求1所述的瘦體重基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試劑包 括：10XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動Taq酶，基因組模板。4. 根據權利要求3所述的瘦體重基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖液包含： lOOmM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。5. 根據權利要求3所述的瘦體重基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試 劑用量為：l〇XPCR緩沖液2. 5μ 1，dNTPs2l·! 1，熱啟動Taq酶0. 1-0. 2μ 1，基因組模板 50-100ng〇6. 根據權利要求1所述的瘦體重基因檢測試劑盒，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠電泳 分析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、DNA無毒染料和DNA上樣緩沖液。7. 根據權利要求6所述的瘦體重基因檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA無毒染料優 選Biotium Gelred無毒染料。8. 根據權利要求1所述的瘦體重基因檢測試劑盒，其特征在于：LBM相關基因對瘦體重 的總貢獻值為各基因對瘦體重貢獻值之和，其單位是公斤。9. 根據權利要求8所述的計算方法，其特征在于：各基因對體重的貢獻值為依分型的 具體結果而定。
【專利摘要】本發明提供了人體LBM（瘦體重）基因檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，試劑包括：（1）針對2個基因SNP多態位點的PCR反應引物組（2）PCR擴增試劑（3）瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發明通過PCR引物的設計使多個PCR擴增反應可在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測的高效性、特異性，分析得到其LBM的遺傳因素，從而為受測者獲得一個合適的健康方案，了解自身的肌肉含量和質量，在健身運動中采取相應的策略避免對其無效甚至是有害的方法。同時為專業運動員的選材和訓練提供科學依據。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105671139
【申請號】
【發明人】李則軒, 張靜靜, 朱軼凡, 別茜, 張舒, 邱嘉銘, 范家成, 盧駿
【申請人】武漢白原科技有限公司, 湖北省體育科學研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年11月17日