鑒別或輔助鑒別外源基因密碼子優化的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域中鑒別或輔助鑒別外源基因密碼子優化的方法。
【背景技術】
[0002] 生物體內編碼同一種氨基酸的同義密碼子使用頻率是不一樣的，有的同義密 碼子在很多個基因中被多次大量使用，而另外的同義密碼子卻很少使用，從而決定密碼 子都有一定的使用頻率。對原核單細胞生物如細菌巧scherichia coli)、真核單細胞 生物如酵母菌（Saccharomyces cervisiae) W 及對果觸值roso地ila melanogaster) 的研究結果表明，不同生物的基因組之間均表現出一定的密碼子偏好性（Gramtja R, et al.1981, Nucleic Acids Res. 9:43-79 ；Sharp P M, et al.1988, Nucleic Acids Res. 16:8207-8211)。密碼子偏好性現象普遍存在，一般認為是生物對翻譯準確性逐 漸提高的自然選擇結果，使得機體基因的表達水平與密碼子的使用頻率偏好性程度密 切相關，高表達的基因比弱表達的基因表現出更明顯的密碼子偏好性（化a巧P M，et al. 1989, Nucleic Acids Res. 17:5029-5038)。轉基因研究表明，原核基因在動植物中表 達量都很低，提高原核基因在動植物中表達的方法之一是進行基因編碼區密碼子的優化。 優先選擇動植物中偏好性密碼子，而盡量不改變氨基酸序列，確保其基因的功能性。例如， 化ederick J和同事們對野生型的crylAb和crylAc基因編碼區進行部分和完全優化，優 化后的基因表達量增加了 10 ~100 倍（Frederick J,et al., 1991, Proceedings of the 化tional Academy of Sciences. 88:3324-3328)。
[0003] 常規鑒定外源基因密碼子優化程度的方法，主要是利用基因工程產生穩定轉化 株，對轉化株作進一步的該外源基因表達檢測，該方法存在穩定轉化周期長的缺點。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是如何鑒別外源基因是否進行了密碼子優化，或密碼 子的優化程度。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明提供了鑒別或輔助鑒別外源蛋白基因是否為受體生 物材料密碼子優化基因的方法，包括如下S1)-S3)的步驟：
[0006] S1)將沒有進行受體生物材料密碼子優化的目的外源蛋白基因作為對照外源基因 轉入所述受體生物材料中得到對照轉基因生物材料；所述受體生物材料表達報告基因，所 述報告基因相對于所述受體生物材料是外源基因；
[0007] S2)將編碼所述目的外源蛋白的待測外源基因轉入所述受體生物材料得到待測外 源基因轉基因生物材料；
[000引 S3)比較所述對照轉基因生物材料和所述待測外源基因轉基因生物材料中所述報 告基因的表達量，確定所述待測外源基因是否為所述受體生物材料密碼子優化基因；如果 所述待測外源基因轉基因生物材料中所述報告基因的表達量高于所述對照轉基因生物材 料中所述報告基因的表達量，所述待測外源基因為所述受體生物材料密碼子優化基因或候 選為所述受體生物材料密碼子優化基因；如果所述待測外源基因轉基因生物材料中所述報 告基因的表達量等于或低于所述對照轉基因生物材料中所述報告基因的表達量，所述待測 外源基因不為所述受體生物材料密碼子優化基因或候選不為所述受體生物材料密碼子優 化基因；
[0009] 所述生物材料為植物、動物或微生物。
[0010] 上述方法中，所述受體生物材料密碼子優化基因是按照所述受體生物材料密碼子 對所述目的外源蛋白基因進行密碼子優化得到的基因。
[0011] 上述方法中，所述沒有進行受體生物材料密碼子優化的目的外源蛋白基因為來源 于非受體生物材料的基因。
[0012] 上述方法中，所述植物具體可為植物細胞、組織、器官或個體；所述動物具體可為 細胞、組織、器官或個體；所述微生物具體可為酵母。
[0013] 上述方法中，所述受體生物材料可為煙草。
[0014] 上述方法中，所述煙草可為本氏煙（化cotiana benthamiana)。
[0015] 上述方法中，所述報告基因為mGFP5基因；所述mGFP5基因編碼下述A1)或A2)的 蛋白質：
[0016] A1)氨基酸序列為序列表中SEQ ID No. 1的蛋白質；
[0017] A2)在A1)的蛋白質的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個 氨基酸殘基得到的具有mGFP5蛋白功能的由A1)衍生的蛋白質。
[0018] 上述方法中，所述mGFP5基因的核巧酸序列為SEQ ID No. 5。
[0019] 上述方法中，所述目的外源蛋白為如下Bl)或B2)的蛋白質：
[0020] B1)氨基酸序列為序列表中SEQ ID No. 2的蛋白質；
[0021] B2)在B1)的蛋白質的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個 氨基酸殘基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白質。
[0022] 上述方法中，所述對照外源基因的核巧酸序列為序列表中SEQ ID No. 4。
[0023] 上述方法中，所述受體生物材料為轉mGFP5基因本氏煙株系16c。
[0024] 上述方法中，所述對照外源基因轉入所述受體生物材料和所述待測外源基因轉入 所述受體生物材料均包括采用農桿菌注射葉片的方法進行轉化。
[0025] 上述方法中，將所述對照外源基因轉入所述受體生物材料和將所述待測外源基因 轉入所述受體生物材料均在同一天進行。
[0026] 上述方法中，在所述轉化后7天-21天（如21天）比較所述對照轉基因生物材料 和所述待測外源基因轉基因生物材料中所述報告基因的表達量。
[0027] 上述方法中，所述報告基因的表達量為葉片中所述報告基因的表達量。
[0028] 上述方法中，所述待測外源基因和所述對照外源基因均由CaMV35S啟動子啟動。
[0029] 實驗證明，將BTW基因進行煙草密碼子的優化后得到的BTM導入本氏煙株系16c 中后，轉基因煙草中mGFP5的RNA沒明顯變化，而將BTW基因導入本氏煙株系16c中后，轉 基因煙草中mGFP5的RNA明顯下降：轉BTM基因煙草葉片中mGFP5的相對表達量為本氏煙 16c的0. 8824倍，轉BTW基因煙草葉片中mGFP5的相對表達量為本氏煙16c的0. 1299倍， 轉BTM基因煙草葉片中mGFP5的相對表達量為轉BTW基因煙草的6. 7934倍。
[0030] 實驗證明，將BTW基因進行煙草密碼子的優化后得到的BTM導入本氏煙株系16c 中后，轉基因煙草中mGFP5蛋白沒明顯變化，而將未經優化的BTW導入本氏煙株系16c中 后，轉基因煙草中mGFP5的蛋白明顯下降帶BTM基因煙草葉片中的mGFP5蛋白量為本氏煙 株系16c的1.0509倍；轉BTW基因煙草葉片中的mGFP5蛋白量為本氏煙株系16c的0. 1089 倍；轉BTM基因煙草葉片中的mGFP5蛋白量為轉BTW基因煙草的9. 6519倍。
[003。 實驗證明，將BTW基因進行煙草密碼子的優化后得到的BTM導入本氏煙株系16c 中后，轉基因煙草中mGFP5的不發生沉默，而將BTW基因導入本氏煙株系16c中后，轉基因 煙草中mGFP5的發生沉默，mGFP5的沉默率達75. 34%。
[0032] 實驗證明，本發明的鑒別或輔助鑒別外源基因密碼子優化的方法可用來鑒別外源 基因密碼子是否優化。本發明方法在短時間內（21天）即可確定外源蛋白基因是否為受體 生物材料密碼子優化基因。<