專利名稱：牛心樸子草提取液及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物控制劑中的天然抗植物病毒病制劑。
近年來殺蟲劑、殺菌劑及除草劑等生物控制劑都取得了迅速的發展，許多農業生產中的病蟲草害都得到了有效地控制。然而由于植物病毒的結構及生理、生化方面的特殊性，目前人類還沒有找到高效、安全的抗植物病毒病的制劑，從而植物病毒對農業的危害及所造成的損失也就愈來愈大，因此目前對高效、安全抗植物病毒病的制劑的需要極為迫切(朱水方，世界農業，1989，1，40-42；Sunsun Kubo，日植病報，1990，65，481-487)。
牛心樸子草(Cynanchum komanovii Al.Iljinski)已有人進行了植物化學研究，并分離出相應的生物堿(方圣鼎，張瑞，陳燕等，植物學報，1989，31(2)，934-938；1991，33(11)，870-875)，但卻沒有報道過該植物有抗植物病毒病活性，更沒有提及7-脫甲氧基娃兒藤堿的抗植物病毒的活性。
本發明的目的是提供一種牛心樸子草提取液及其應用，本發明是一個高效、安全的抗植物病毒病的制劑，對煙草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)有較強的抑制活性，菲駢吲哚里西定類生物堿(phenanthroindolizidine alkaloids)是其活性部位。
本發明是采自內蒙古西部沙生的牛心樸子草(Cynanchum komanovii Al.Iljinski)的地上部分的乙醇提取物，其主要成分是下述生物堿化合物，7-脫甲氧基娃兒藤堿(antofine)為其主要有效活性成分 X＝H、OCH3Y＝O、電子對； 7-脫甲氧基娃兒藤堿7-脫甲氧基娃兒藤堿的CA登錄號為054781-87-2。(Ralph C.Bick and WanneeSinchaiThe Alkaloids XIX，Academic Press，Inc.1981.Chapter 3，Phenanthroindolizidine and Phenanthroquinolizidine Alkaloids，pp191)本發明實施方法描述如下
將盛花期收割的牛心樸子草的地上部分自然風干、切碎，用重蒸工業乙醇提取三至四次，提取液脫溶后得黑色的乙醇浸膏。然后按常規方法將其分為中性、酸性及堿性部位。生物活性測定表明只有堿性部位有明顯的上述生物活性。堿性部位經Saphadex LH-20凝膠柱、硅膠柱分離出化合物1，2，3。經重結晶進一步純化后進行物理常數及光譜數據測定，最后確定其結構。 1，7-脫甲氧基娃兒藤堿 2，N-氧化7-脫甲氧基娃兒藤堿3，娃兒藤堿antofine N-oxide antofinetylophorine其中1的含量最大，允許進行較細致的生物活性測定，本發明有很高抗煙草花葉病毒(TMV)活性，在500ppm濃度枯斑抑制率達70～90％，超過對照藥病毒A、病毒唑、DADHT和DHT(DADHT和DHT均為國外已商品化植物病毒防治藥物)，對馬鈴薯病毒Y的防治效果也好于DADHT。進一步采用生物活性跟蹤方法確定活性部位為生物堿，該生物堿(總堿)在50ppm濃度枯斑抑制率達到70～80％。對該生物堿(總堿)進一步分離和結構、生物活性鑒定，證明活性組份為7-脫甲氧基娃兒藤堿，1ppm濃度下對煙草花葉病的抑制率仍達60％，比目前最常用的抗煙草花葉病制劑的活性高出1～2個數量級。很明顯本發明所發現的這個活性物質將可作為一個高效的抗植物病毒病，特別是抗煙草花葉病的制劑。不僅如此，本發明所涉及到的牛心樸子草的粗提物以及分離出來的總生物堿都可用作抗植物病毒病，特別是煙草花葉病的制劑。
本發明發現牛心樸子草的地上部分的乙醇提取液總生物堿對植物病毒病，特別是對煙草花葉病有明顯的抑制作用；該植物提取液中的生物堿部位是抑制植物病毒病的主要部位；該生物堿部位中主要活性組份為菲駢吲哚里西定類生物堿；該生物堿中主要活性組份1為7-脫甲氧基娃兒藤堿(antofine)；7-脫甲氧基娃兒藤堿對植物病毒病，特別是對煙草花葉病有很強的抑制作用；本發明突出的實質性特點和顯著效果可以從下述的實施例得以體現，但它們不是對本發明作任何限制。
實施例將盛花期收割的內蒙古西部沙生的牛心樸子草的地上部分自然風干、切碎，取10kg用重蒸的工業乙醇(蓋住植物材料為度)常溫浸取三次，合并提取液，真空脫溶(40℃)得1185g黑色粘稠浸膏。此浸膏對煙草花葉病毒病的抑制率為70％(1000ppm)。
將所得的浸膏150g與500mL 5％的檸檬酸水溶液攪拌溶解，用250mL乙酸乙酯提取三次，合并提取液并用250mL 5％的氫氧化鈉溶液提取三次，分出有機相，用無水硫酸鈉干燥，真空脫溶，得黑色的粘稠物35g，即為中性部位；合并氫氧化鈉提取液，用10％的鹽酸酸化到pH＝3～4后再用250mL乙酸乙酯提取三次，合并乙酸乙酯提取液，無水硫酸鈉干燥，真空脫溶，得酸性部位21g。檸檬酸的水溶液經抽濾除去不溶性雜質后，用25％的氨水中和到pH＝10后，用三氯甲烷250mL提取三次，合并提取液，用無水硫酸鈉干燥，真空脫溶得0.8g堿性物質，即堿性部位。生物活性測定表明只有堿性部位有明顯的抑制植物病毒活性。
所得的堿性物質首先進行凝膠色譜(Sephadex LH-20，CHCl3∶CH3OH＝1∶1)以除掉含糖類的物質。然后進行硅膠柱層析(山東海洋化工廠快速柱層析用硅膠，150g，洗脫液為三氯甲烷∶甲醇∶水三元混合物的下層，10∶1∶1，5∶1∶1，5∶2∶1)，用薄層色譜檢測洗脫液中的生物堿(顯色劑為Dragendorf試劑)，將含有同一物質的餾份合并，脫溶，然后用三氯甲烷與甲醇的混合物重結晶得到化合物145mg，216mg，38mg。
1淺黃色的晶體，m.p.205～208℃，[α]D25＝-195°。MS直接進樣，M+363(79％)，294(100％)。1H NMR，13C NMR均與已知化合物7-脫甲氧基娃兒藤堿(antofine)一致。
2無色針狀晶體，m.p.197～198℃，[α]D25＝-65°。MS直接進樣，M+379(3％)，363(25％)，294(100％)。1H NMR，13C NMR均與N-氧化7-脫甲氧基娃兒藤堿一致。
3淺黃色晶體，m.p.289-291℃，MS393(35％)，324(100％)。
化合物1、2和3的部分核磁數據見表1。
表1化合物1，2和3的核磁數據(CDCl3，TMS＝0ppm) Fumiko Abe，Yukiko Inase，Tatsuo Yamauchi，et al.，Phytochemistry，1995，39(3)，695～699生測方法1、半葉法。
供試毒源1)、煙草花葉病毒TMV(tobacco mosaic virus)；2)、馬鈴薯Y病毒PVY(Potato Virus Y)。
供試植物三生煙(Nicotiana tabacum cv.Samsum，TMV系統寄主，用于繁殖毒源)；珊西煙(N.Tabacum cv.Xanthi-NC，TMV枯葉寄主，用于抗病毒生物活性測定)。
病毒接種用汁液磨擦接種法。取新鮮典型TMV病毒癥狀的三生煙病葉，加入磷酸緩沖溶液(0.01M，pH7.2)，在研缽中研碎，然后用沸水煮過的截頭毛筆蘸取汁液，在撒有金剛砂的珊西煙葉面上接種，并用清水快速沖洗，靜置片刻后再移動。
樣品處理TMV接種1.5～2小時后，剪下接種葉片，沿著葉片主脈剪成兩個相等半葉，一半葉片用不同化合物浸葉處理，另一半葉片浸于清水作對照，72小時后調查統計半葉枯斑數。抑制百分率按下面公式計算
所提取的混合物及分離的化合物的生物活性測試結果見表2。
表2抗煙草花葉病毒活性
*DADHT1，5-二乙酰基-2，4-二氧六氫-1，3，5-三嗪**DHT2，4-二氧六氫-1，3，5-三嗪2、植株法利用植株法測試了牛心樸子草的粗提物與DADHT的防治TMV和PVY的活性，方法如下A先接種后噴藥，病毒接種同半葉法，TMV接種1.5～2小時后，噴施不同濃度的有機化合物，另設清水對照，72小時后調查統計葉片枯斑數；B先噴藥后接種，先噴施化合物24小時后，接種TMV病毒(方法同半葉法)，另設清水作對照，72小時后調查統計葉片枯斑數。
試驗結果見表3。
表3粗提物盆栽試驗結果，500ppm
權利要求
1.一種牛心樸子草提取液，它的主要成分是下述生物堿化合物 X＝H、OCH3；Y＝O、電子對；其特征在于制備方法如下將盛花期收割的牛心樸子草的地上部分自然風干、切碎，用重蒸工業乙醇提取三至四次，得到乙醇提取液，提取液脫溶后得黑色的乙醇浸膏。
2.權利要求1所說的牛心樸子草提取液的應用，其特征在于它用于植物病毒病的抑制。
3.按照權利要求2所說的牛心樸子草提取液的應用，其特征在于它用于煙草花葉病毒TMV、馬鈴薯Y病毒PVY的抑制。
4.按照權利要求2、3所說的牛心樸子草提取液的應用，其特征在于它的有效活性成分是7-脫甲氧基娃兒藤堿，使用濃度是1-1000ppm。
全文摘要
本發明涉及牛心樸子草(Cynanchum komaroviiAl.Iljinski)粗提取物及抗植物病毒活性。牛心樸子草的地上部分的乙醇浸膏中抗煙草花葉病毒病的活性組份為菲駢吲哚里西定(phenanthroindolizidine)類生物堿,其中7－脫甲氧基娃兒藤堿(antofine)為其主要活性組份,其活性比目前市場上廣泛使用的抗煙草花葉病的制劑高1～2個數量級。本發明可應用于植物病毒病的防治,特別是煙草花葉病的防治。
文檔編號A01N43/36GK1321642SQ0010623
公開日2001年11月14日 申請日期2000年4月28日 優先權日2000年4月28日
發明者李廣仁, 安天英, 楊昭, 黃潤秋, 李在國, 姚宇澄, 于學舜, 高俊 申請人:南開大學, 內蒙古工業大學