專利名稱：煙草節桿菌作為對蝦飼料添加劑的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種煙草節桿菌，特別是涉及煙草節桿菌用作飼料添加劑以提高對蝦免疫力和抗病力的應用。
背景技術：
近年來，對蝦養殖業已進入大規模的工場化養殖階段，但是，一直遭受著病害的困擾，主要是細菌病和病毒病。目前，抗生素作為防治藥物雖然便捷有效，然而，耐藥菌株的產生使抗生素的療效越來越不理想，并且變異病原菌往往會引起更為嚴重的疾病。另外，抗生素在水產品中的殘留也直接威脅著人類的健康與安全。接種疫苗是目前水產養殖上預防傳染性疾病一個最為有效的辦法，但疫苗針對性強、作用范圍小。對于特異性免疫系統不夠發達或缺乏的低等無脊椎動物(如蝦、貝類等)作用有限。
發明內容
本發明的目的在于將煙草節桿菌作為飼用益生菌添加到對蝦飼料中，通過提高非特異性免疫力來提高養殖對蝦對傳染性疾病的抵抗力，能彌補煙草節桿菌作為對蝦飼料添加劑的應用。
本發明中所用的煙草節桿菌在對蝦飼料中的添加量為108CFU/g飼料時，能夠顯著的減少對蝦腸道中弧菌的數量，顯著的提高對蝦的非特異性免疫力。當添加量為108～1010CFU/g飼料時，顯著的提高養殖對蝦對副溶血弧菌的抵抗力，從而顯著的降低對蝦的死亡率。它具有比抗生素更安全而且比疫苗作用更廣泛等優點。
附圖1為飼喂含有不同水平煙草節桿菌飼料對蝦的腸道弧菌數在不同時間點的測定結果示意圖。
附圖2為飼喂含有不同水平煙草節桿菌飼料對蝦的血細胞數在不同時間點的測定結果示意圖。
附圖3為飼喂含有不同水平煙草節桿菌飼料對蝦的血清酚氧化酶活性在不同時間點的測定結果示意圖。
附圖4為飼喂含有不同水平煙草節桿菌飼料對蝦的血細胞吞噬活性在不同時間點的測定結果示意圖。
附圖5為飼喂不同水平煙草節桿菌飼料對蝦的血細胞呼吸爆發活性在不同時間點的測定結果示意圖。
附圖6為飼喂不同水平煙草節桿菌飼料對蝦的血清磷酸酶活性在不同時間點的測定結果示意圖。
附圖7為飼喂不同水平煙草節桿菌飼料的對蝦在攻毒期間累計死亡率的示意圖。
以上各圖中均以P＞0.05為標準，對三個重復的平均數進行最小二乘法(LDS)多重比較，差異不顯著的處理組數值標有相同的英文字母。
具體實施例方式
本實施例所用的煙草節桿菌由中國海洋大學水產動物營養研究室分離自中國對蝦養殖水體，經中國科學院微生物研究所鑒定，確定為煙草節桿菌(Arthrobacter nicotianae)。所用的病原性弧菌副溶血弧菌是由黃海水產研究所海水增養殖病害與生態研究室提供，在攻毒試驗中用作致病菌。試驗用蝦為體長5-6cm的凡納濱對蝦(Penaeus vannamei)，購自青島對蝦養殖場。所用的飼料原料購置青島農貿市場。對蝦血液抗凝劑參照Vargas-Albores(1993)的配方進行配制，測定血清酚氧化酶和呼吸爆發活性所用的次甲砷酸鈉緩沖液(CAC)參照Hernández-López(1996)的配方配制，所用的化學藥品購自Sigma公司。
飼料原料經粉碎通過80目篩，按基礎飼料(表1)配方稱取原料，并充分混合。在該基礎飼料中分別添加4水平的煙草節桿菌(0，106，108，1010CFU/g飼料)做成基礎飼料(Diet0)、試驗飼料1(Diet1)、試驗飼料2(Diet2)和試驗飼料3(Diet3)共4種飼料。根據試驗餌料所需的添加量，先用生理鹽水將新鮮的煙草節桿菌細胞培養液稀釋，然后和基礎飼料按1∶3(重量比)的比例進行混合均勻。常溫下擠壓制粒，利用風扇在室內吹干后放置于潔凈的塑料袋內，儲存在4℃的冰箱內待用。每2周做一次新鮮飼料。
飼養試驗開始前將對蝦馴養10天后，隨機分成12組，每組75尾放養于流水式的水族箱(300-1)內，連續充氣。每種飼料隨機安排3個水族箱。試驗期間養殖水體的鹽度和溫度分別控制在29‰--31‰和25-29℃之間。
飼養試驗開始后的第7天、21天和第49天采樣，第50天封閉流水養殖系統，用副溶血弧菌(107CFU/ml)水浴攻毒，并于攻毒后第16天采樣，統計對蝦的存活率。每次采樣從每個桶中隨機取6尾對蝦，用1ml無菌注射器自對蝦的腹血竇中取血，按1∶2(按體積)的比例和對蝦血液抗凝劑充分混合，置于離心管中。取部分血淋巴用于血細胞計數、細胞吞噬百分數和呼吸爆發活性的測定，取部分血淋巴液在4℃下以300×g離心30min，取血淋巴上清液用于酚氧化酶活性和磷酸酶活性的測定。采集血淋巴液后的對蝦用于對蝦腸道弧菌計數。
表1.基礎飼料配方(g/100g飼料)原料配比魚粉43.6面粉22.5豆粕9.5花生粕 14烏賊粉膏3魷魚內臟粉 2
大豆卵磷脂 2優質海魚油 1黃豆油 1復合維生素 0.2維生素C 0.03復合礦物質 0.5KH2PO40.37氯化膽堿(50％) 0.25抗氧化劑0.05合計100注復合維生素和復合礦物質由青島瑪斯特生物技術有限公司提供。
計數腸道弧菌數時，先無菌操作將對蝦解剖，取腸道分別置于無菌勻漿器，加1ml無菌的生理鹽水勻漿，取勻漿液進行10倍系列稀釋，再取0.1ml涂布弧菌培養基(TCBS)，28℃培養2天后統計菌落數，統計對蝦腸道中弧菌數。
血細胞計數是利用血球計數板在光學顯微鏡400倍下直接計數，計算出每毫升血淋巴中的血細胞數目。
酚氧化酶活性測定參照Hernández-López(1996)的方法，取50μl血清樣品和50μl L-Dopa(3mg/ml CAC)加入96孔微孔板。于室溫下混合均勻，25℃下水浴10min，每隔1min用酶標儀(TECAN SAFIRE)讀取O.D.492值。采用以牛血清蛋白為標準蛋白的方法測定血清蛋白的濃度(Bradford，1976)。以試驗條件下每mg血清蛋白氧化底物時，每min O.D.492值增加0.001即定義為一個酶活力單位。
血細胞吞噬活性測定參照Park和Jeong(1996)方法進行。用磷酸緩沖液(0.02M；pH7.5)配制濃度約為107細胞/ml的酵母懸液。每個樣品取0.1ml的血淋巴液和0.1ml酵母懸液混合，置于96孔微孔平板內，充分混勻。然后置于水浴鍋中，25℃下培育30min。平均每10min搖勻一次。培育完畢后，每個樣品取3份各50μl反應混合液均勻的涂布于潔凈的載玻片上。待晾干后，滴加無水甲醇固定3min，用對蝦血液抗凝劑沖洗，晾干。再用姬姆薩染液染色5min。在光學顯微鏡下觀察，計數發生吞噬的血細胞。細胞吞噬％采用以下公式計算細胞吞噬百分數＝視野內吞噬酵母的血細胞數/視野內血細胞總數×100％。
呼吸爆發活性測定參照Song和Hsieh(1994)的方法。其原理為用四唑氮藍(NBT)的減少量來測定過氧化物離子的產量。在96孔微孔平板中進行反應，每孔中滴加50μl 0.2％多聚賴氨酸水溶液(0.2g多聚賴氨酸溶解于100ml水溶液)后，每個樣品取100μl血細胞加入微孔平板孔中。待血細胞沉淀后，用CAC反復沖洗后，在4℃下以300×g離心10min，去除上清液，加入100μl冰冷的CAC溶液。然后加入100μl 0.3％NBT(0.3g NBT溶解于100mlCAC溶液)，37℃下染色30min后，用無水甲醇終止染色反應。每個孔用70％甲醇水溶液(甲醇和水體積比為7∶3)沖洗三次，風干后，加入60μl 2M KOH水溶液和70μl DMSO，充分溶解后，利用酶標儀(TECANSAFIRE)讀取O.D.630值。以該試驗條件下，用100μl血淋巴液中的血細胞產生的過氧化物離子量來衡量呼吸爆發活性。
以硝基苯磷酸二鈉(PNPP)為底物測定酸性磷酸酶活性，根據其一定酸堿條件下反應生成對硝基酚的含量來衡量磷酸酶活性(Kuda等，2002)。取50μl血清加入100μl 0.1Mmol NaAC-HAC(pH4.5)緩沖溶液中，其中含有20mM硝基苯磷酸二鈉(PNPP)，于37℃反應30min，加入100μl 0.2M NaOH的水溶液終止反應。在520nm下測定對硝基酚的生成量。血清蛋白濃度的測定采用以牛血清蛋白為標準蛋白的方法(Bradford，1976)。酸性磷酸酶活力單位規定血清中每mg酶蛋白在37℃下與底物作用每min產生1mg對硝基酚為1個活力單位。
用SPSS(版本11.0)軟件包對所有實驗數據進行ANOVA分析，不同處理之間的顯著差異性(P＜0.05)用最小二乘法(LSD)進行多重比較。
從圖1中可以看出，長時間持續飼喂煙草節桿菌影響對蝦腸道中的弧菌數，隨著煙草節桿菌的添加量增加腸道中弧菌數呈下降趨勢，用副溶血弧菌攻毒后，對蝦腸道中弧菌數有上升趨勢，并且隨著煙草節桿菌飼喂量的增加腸道中弧菌數下降的趨勢更加明顯。
從圖2可以看出，對蝦的血細胞數隨著飼料中煙草節桿菌添加量的增加而呈上升趨勢，當煙草節桿菌添加量為108CFU/g時，對蝦的血細胞數目最大。用副溶血攻毒后，各組對蝦的血細胞數目下降，飼喂含有1010CFU/g煙草節桿菌的對蝦血細胞數最大。
從圖3可以看出，對蝦的血清酚氧化酶活性隨著飼料中煙草節桿菌添加量的增加而呈上升趨勢，當煙草節桿菌添加量為108CFU/g時，對蝦的血清酚氧化酶活性最大。用副溶血弧菌攻毒后，各組對蝦血清酚氧化酶活性升高，且隨著飼料中煙草節桿菌添加量的增加而上升。
從圖4可以看出，對蝦血細胞吞噬百分數隨著飼料中煙草節桿菌添加量的增加而呈上升趨勢，當添加量為108CFU/g時，對蝦的血細胞吞噬活性最大。用副溶血弧菌攻毒后，各組對蝦血細胞吞噬活性下降，但是，飼喂含有108CFU/g煙草節桿菌的對蝦血細胞吞噬百分數最大從圖5可以看出，對蝦血細胞呼吸爆發活性隨飼料中煙草節桿菌添加量的增加而呈上升趨勢，當添加量為108CFU/g時，對蝦的血細胞吞噬活性最大。用副溶血弧菌攻毒后，各組對蝦血細胞呼吸爆發活下降，飼喂含有108CFU/g煙草節桿菌的對蝦血細胞呼吸爆發活最大。
從圖6可以看出，對蝦的血清酸活性磷酸酶隨著飼料中煙草節桿菌添加量的增加而呈上升趨勢，當添加量為108CFU/g時，對蝦的血清磷酸酶活性最大。用副溶血弧菌攻毒后，各組對蝦血清磷酸酶活性上升，但是，飼喂108CFU/g煙草節桿菌的對蝦血清磷酸酶活性最大。
由圖7可知，飼料中添加煙草節桿菌能增強養殖對蝦對副溶血弧菌的抵抗力，降低對蝦的死亡率，其中飼喂含有108～1010CFU/g煙草節桿菌的對蝦的死亡率顯著的低于對照組。
權利要求
1.煙草節桿菌作為對蝦飼料添加劑的應用。
全文摘要
煙草節桿菌作為對蝦飼料添加劑的應用。本發明中所用的煙草節桿菌在對蝦飼料中的添加量為10
文檔編號A23K1/18GK1593187SQ200410024439
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月7日 優先權日2004年7月7日
發明者李繼秋, 譚北平, 麥康森, 徐瑋, 劉付志國, 艾慶輝, 張文兵, 馬洪明 申請人:中國海洋大學