一種微貯添加劑、其制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及飼料領域，主要涉及一種飼料添加劑，具體涉及一種微貯添加劑、其制 備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 秸桿微貯飼料是近年來發展迅速的一種秸桿加工新技術，它利用微生物在秸桿中 密封發酵使秸桿變成帶有酸、香、酒味的粗飼料，是節能環保高效的農牧業產品。微貯飼料 因其具有成本低、效益高、適口性好、采食量高、飼料來源廣、不受季節限制而得到了廣泛應 用。
[0003] 我國每年約產生秸桿近6億噸，其中約有70%的秸桿作為生活能源的形式消耗，經 處理后喂家畜的不足8%，另一部分以肥料的形式還田，造成環境污染和能源損失。隨著畜 牧業的不斷發展，我國牧草飼料年供應缺口達2.8億噸，每年有6億噸秸桿資源亟待處理，而 目前大量秸桿的不良處置，如焚燒，嚴重影響到空氣質量和引發大量的交通事故;如直接填 埋在田地里面，長期后會破壞土壤結構，減少土壤肥力并影響到農作物的生長。
[0004] 秸桿的消化率低，一般只有35-50 %，其中的能量只有60 %能被動物利用。秸桿細 胞壁中木質素與半纖維素之間結合的乙酰基團是影響微生物酶消化的主要原因。而目前多 采用添加多種菌種制備秸桿作物，1989年美國飼料公定協會(AAFC0,1990)公布了可以用作 飼料添加劑、對人畜均無副作用的微生物，共有43種，其中乳酸菌28種(包括乳桿菌12種、雙 歧桿菌6種、鏈球菌6種、片球菌3種、明串珠菌1種）、芽孢桿菌5種、擬桿菌4種、曲霉2種、酵母 菌2種等。
[0005] CN 102178126 A公開了一種秸桿微貯添加劑，采用乳酸菌、啤酒酵母、枯草芽孢桿 菌、放線菌、固氮菌、霉菌菌種按75300~10000:73000~10000:600~500:70~50:15~10:1 的配比發酵制得。CN 101263864 A公開了一種秸桿微貯添加劑，所述秸桿微貯添加劑由產 朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳桿菌、乳酸片球菌按重量比配制而成。而這兩個專利中的菌 種過于單一，菌種分泌酶類單一，合成物質不足，且發酵所需時間過長不利于秸桿飼料的制 備。
【發明內容】
[0006] 針對現有技術的缺陷和不足，本發明提供了一種微貯添加劑、其制備方法及應用， 該添加劑通過多種菌種之間的協同作用，提高了秸桿粗纖維、干物質和蛋白質的利用效率， 同時產生了多種有機酸及菌體蛋白。
[0007] 為達上述目的，本發明采取以下技術方案：
[0008] -方面，本發明提供一種微貯添加劑的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳 桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母和沼澤 紅假單胞菌劑按單位質量活菌數比例為：（500-600): (500-600): (10000-75000): (10000- 73000):(10000-75000)：(10000-73000)：(10000-73000)：(10000-65000):(10000-60000)： (10000-75000): (10000-75000): (50-70): 1混合，制備得到微貯添加劑。
[0010] 本發明中，采用13種菌混合，通過菌種間協同作用對秸桿進行發酵處理，可以快速 提高秸桿發酵水平，彌補單一菌種分泌酶類及合成物質的不足，提高了發酵品質，同時產生 的多種有機酸及菌體蛋白，能夠提高秸桿的適口性，提高畜禽的采食量，顯著提高畜禽的生 產性能。
[0011] 優選地，所述的秸桿微貯添加劑的制備包括以下步驟：
[0012] ⑴菌種活化；
[0013] ⑵種子液制備；
[0014] (3)培養基配制及接種；
[0015] ⑷發酵；
[0016] (5)菌體收集及菌劑制備；
[0017] (6)微貯添加劑的制備。
[0018] 優選地，步驟（1)所述的菌種活化包括如下步驟:將保藏的地衣芽孢桿菌、枯草芽 孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳 酸片球菌、戊糖片球菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母和沼澤紅假單胞菌，分別置于滅菌的1%紅 糖水中活化2h，芽孢菌再轉接入已滅菌的普通肉湯培養基、乳酸菌轉入MRS、酵母菌轉入YPD 斜面培養基中，置于28-35°C，待菌落長出后分別接入已滅菌的普通肉湯MRS、YPD培養基中， 在與對應斜面培養基相同溫度的搖床中培養24-48h。
[0019] 優選地，步驟(2)所述的種子液制備包括如下步驟:將已滅菌的500mL與試管培養 基成分相同的13個錐形瓶培養基，搖瓶于32-34 °C空白培養48h，檢查確認無雜菌后包扎，用 紫外線照Ih備用；將普通肉湯培養基、MRS、YPD長出的菌落、挑單菌落于與其相對應的己滅 菌的13個培養基錐形瓶中，置于28-35Γ下搖瓶培養24-48h，鏡檢無雜菌后制成種子液。
[0020] 優選地，步驟(3)所述的培養基配制及接種包括如下步驟：
[0021] (a)將發酵罐和所用設備121°C滅菌30min，維持罐壓O.IMPa;
[0022] (b)配置培養基:將毛尖蘑菇菌、松茸蘑菇菌、灰樹花蘑菇菌、雞腿蘑、白蘑菇菌和 黃蘑菇菌按2:2:1:3:1:1的比例制成蘑菇菌粉放入蜂蜜、紅糖，高溫消毒，加入井水消毒，降 溫后分別接菌發酵，再加入淀粉酶、麥芽糖酶和木聚糖酶，反應72小時產生自組互控菌群及 產生生物酶。
[0023] 本發明中，在培養基中加入蘑菇菌粉，與其他培養基相比，更有利于對這幾種菌的 擴繁，使得擴繁效果更佳，加入這三種酶類，便于產生更多的酶，加快發酵速度。
[0024]優選地，所述步驟(b)中蘑菇菌粉、蜂蜜和紅糖的比例為70:3:125。
[0025] 優選地，所述步驟(b)中的消毒溫度為150-200 °C，例如可以是150 °C、160 °C、170 °(：、180°(：、190°(：或200°(：，優選為160-180°(：，進一步優選為160°(：。
[0026] 優選地，所述淀粉酶、麥芽糖酶和木聚糖酶的比例為1: 1:1。
[0027] 優選地，所述淀粉酶、麥芽糖酶和木聚糖酶的總酶量與蜂蜜的比為1:1。
[0028]優選地，步驟(4)所述發酵的參數為：
[0029]所述地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的培養溫度為33-36°C，起始pH為7.0-7.2，通氣 量為I_3V/V/min，攪拌轉速為280-320r/min，罐壓為0.12-0.14MPa，培養時間45-50h;
[0030] 所述兩歧雙歧桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌和沼澤紅假單胞菌的培 養溫度為25-30 °C，起始pH為6.2-6.4，通氣量為l-3V/V/min，攪拌轉速為180-220r/min，罐 壓為0 · 12-0 · HMPa，培養時間 18-28h;
[0031] 所述乳酸腸球菌、乳酸乳桿菌和乳酸片球菌的培養溫度為33-36Γ，起始pH為5.8-6.4，不通氣，攪拌轉速為120-200r/min，罐壓為0.12-0.14MPa，培養時間15-20h;
[0032] 所述嗜酸乳桿菌的培養溫度為25-30°C，起始pH為6·0-6 ·4，通氣量為l-3V/V/min， 攪拌轉速為180_220r/min，罐壓為0.12-0.14]\〇^，培養時間15-2311 ;
[0033] 所述產朊假絲酵母和釀酒酵母的培養溫度為25-30°C，起始pH為4.6-5.0，通氣量 為 I -3V/V/min，攪拌轉速為 380-420r/min，罐壓為 0.3-0.4MPa，培養時間 45-50h。
[0034]本發明中，各菌的具體發酵參數如下：
[0036]優選地，步驟(5)所述菌體收集包括如下步驟:將以上放罐后的發酵液置于20°C冷 激處理3h，6000rpm離心5min，去上清收集菌泥。
[0037] 優選地，步驟(5)所述菌劑制備包括如下步驟:按蔗糖10%、脫脂牛乳10%、谷氨酸 鈉5%配比制備凍干保護劑；向菌泥中加入與棄去上清液等體積的保護劑，使菌體重懸，于_ 70°C預凍1.5h，再冷凍干燥，干燥完畢后將產品密封于膠袋中于_20°C備用。
[0038] 優選地，步驟(6)所述的微貯添加劑的制備包括以下步驟：
[0039] (a)凍干劑單位質量活菌數測定:取出保存的冷凍干燥劑若干克，迅速加入4 °C預 冷的無菌蒸餾水于22°C振蕩lOmin，使菌體重懸，倍比稀釋后活菌計數，確定凍干劑活菌數 活菌計算公式：
[0040] ff=m/ (nXVo/Vi)
[0041] W=單位質量活菌數，cfu/g;
[0042] m =樣品質量，g;
[0043] η =菌落平均數，cfu;
[0044] Vo =菌落總體積，mL;
[0045] Vi =涂布用量，mL;
[0046] (b)根據每種菌劑單位質量活菌數按地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿 菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球 菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母和沼澤紅假單胞菌的配比為(500-600) :(500-600):(10000-75000):(10000-73000)：(10000-75000)：(10000-73000)：(10000-73000)：(10000-65000)： (10000-60000): (10000-75000): (10000-75000): (5