專利名稱：制備植物單倍體胚和單倍體植株的方法
技術領域：
本發明屬植物栽培領域，具體涉及一種制備植物單倍體胚和單倍體植株的方法。
背景技術：
將只具有配子體染色體組分的個體、組織或細胞在離體條件下培養，使其發育成完整的植物體，這種具有單套染色體的植物稱為單倍體植物(Haploid Plant)。單倍體在植物遺傳育種具有重要意義①通過單倍體培養和染色體加倍可快速獲得異花授粉作物的自交系和無性系。②通過單倍體培養中的變異創造新的種質資源。③誘變單倍體可迅速發現隱性突變。④在植物生殖機理的理論研究有重要作用，如單倍體與二倍體雜交得到的非整倍體有助于解決測定連鎖群，二倍體的染色體組成分，基因劑量的作用等一些問題，也為現代基因工程研究提供了很好的受體材料(張麗，王靜，十字花科作物單倍體育種研究進展.安徽農業科學，2003 31(2)231～234)。
然而，自然界中，單倍體自發產生的頻率極低，僅為0.001～0.01％，這大大地限制了單倍體的應用。為了高頻率誘導單倍體，人們嘗試了多種方法(孫志棟，王學德，毛根富等，作物單倍體研究和應用進展.種子，2000.(6)37～39)。長期以來，利用花藥、花粉作外植體進行組織培養，從小孢子經愈傷組織或胚狀體產生植株，一直是產生單倍體植物的重要要途徑。而利用花藥、花粉誘導單倍體的孤雄生殖方法，采用花藥、花粉作外植體進行組織培養，從小孢子經愈傷組織或胚狀體產生植株，程序復雜，培養條件要求苛刻，操作繁瑣，費用高昂。
San Noeum(San Noeum L H，Haploids d’Hordeum vulgare L.par culture in vitro d’ovaries non fecondes.Ann Amelior Plant，1976.24751～754)首次通過大麥(Hordeumvulgare)未授粉子房培養得到單倍體植株，并采用“離體孤雌生殖(in vitro gynogenesis)”的術語來說明在離體條件下未受精胚囊細胞產生單倍體植株的現象，開辟了植物離體孤雌生殖這一獲取單倍體植物的途徑。隨后，相繼從多種植物的未授粉子房或(和)胚珠離體培養得到單倍體(楊江義和李旭鋒，2002)。植物離體孤雌生殖最初主要是未授粉胚珠或子房的培養，但根據對這方面研究的統計，近年來有越來越多的研究者通過培養花蕾甚至花序來獲得雌性單倍體。近年來離體孤雌生殖研究取得了很大進展，在一些植物品種上篩選出了重復性較好的培養程序，但總體來說誘導頻率都還偏低，有必要進一步改進培養技術，提高誘導頻率(楊江義，李旭鋒，2002.植物雌性單倍體的離體誘導.植物學通報，19(5)552～559)。研究表明，影響雌性單倍體離體誘導頻率高低的因素很多，涉及供體植株的基因型、供體植株的生理狀態、胚囊發育時期、培養基、接種方式、花器附屬物影響、培養條件等多個因素。此外，以上因素之間還存在著復雜的相互作用(楊江義，李旭鋒，植物雌性單倍體的離體誘導.植物學通報，2002.19(5)552～559)。而且由于影響因素多，所以難于找到一個普遍適用的操作流程，每一種植物要能成功地進行雌性單倍體離體誘導都需要反復的摸索和大量的實驗。
到1995年，通過未受精子房和胚珠培養成功的植物僅有7個科的19個種(孟金陵等，植物生殖遺傳學1995.北京科學出版社)，而且相關研究多集中在禾本科、茄科及菊科，占全部培養成功種的2/3，尤以禾本科植物研究最多，占全部種的1/3(馬三梅張改生，劉宏偉等，異源細胞質誘導小麥單倍體的研究與進展.陜西農業科學，1998.(4)3～9)。目前離體孤雌生殖應用得最成功的植物是甜菜，其次是洋蔥、非洲菊、煙草等非木本的植物(楊江義，李旭鋒，2002.植物雌性單倍體的離體誘導.植物學通報，19(5)552～559)。木本植物離體孤雌生殖的研究僅在核桃上有相關報道。
目前所采用的利用未授粉子房或(和)胚珠離體培養得到單倍體的離體孤雌生殖方法，存在程序復雜，培養條件要求苛刻，操作繁瑣，費用高昂等不足之處。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種制備植物單倍體胚的方法。
該方法包括以下步驟a、在植物開花前，剪去花中的1～(n-1)個柱頭；b、在花瓣開放時，給保留的柱頭進行人工授粉；c、當植物果實即將轉入成熟時，從未受精的胚囊中取出單倍體胚；步驟a中所述的n為該植物花中的柱頭數。
進一步的，在上述的步驟a中，在剪去柱頭時，應使保留的柱頭均勻分布。
進一步的上述的植物是薔薇科Rosaceae植物。
更進一步的上述的薔薇科植物是枇杷屬Eriobotrya Lind1植物。
本發明的第二個目的是提供使用上述的方法所制備得到的植物單倍體胚。
本發明的第三個目的是提供一種制備植物單倍體植株的方法。
該方法包括以下步驟
a、直接將上述的植物單倍體胚接種于培養基上，培養成苗；b、對苗進行煉苗，以適應外界環境。
進一步的上述的a步驟中的培養基為含有6-BA 0.1～0.5mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L和IBA 0.02～0.1mg/L的MS培養基。
優選的上述的a步驟中的培養基為含有6-BA0.5mg/L，NAA0.02mg/L和IBA0.02mg/L。
上述a步驟中的培養基還可含有0.1～0.5％的活性炭。
更進一步地，上述a步驟中的培養基含有0.2％的活性炭。
更進一步的上述的a步驟中的培養條件為溫度25±1℃，黑暗條件下培養5～15天后，在光照2000±500lux、14～18h/d下，培養一個月。
本發明的第一個目的所提供的制備植物單倍體胚的方法，其適用范圍廣泛。在該方法的操作過程中要注意以下事項1、步驟a要選取發育健壯的花序并疏花，每花序留2～5朵花，以便日后果實能獲得充足的營養供應。
2、去柱頭須在開花前，也就是指一般所說的花尚未開放的燈籠花期(即花已成熟，在當天或1～2天后將開放的時期)進行，以確保未發生授粉受精過程。
3、在步驟a中，在剪去柱頭時，應使保留的柱頭盡量均勻分布。比如在保留柱頭較多的情況下應盡量間隔剪去；而在保留較少柱頭的情況下應在使保留的柱頭均勻分布的同時，保證中心區域(柱頭區域的中心)留有至少一個柱頭。
4、給其余的柱頭授以足量花粉，使柱頭粘滿花粉，確保其完成受精過程，形成足量正常種子，以創造適宜的激素和營養環境，誘發去掉柱頭的胚珠孤雌生殖。
5、步驟c中的植物果實即將轉入成熟時是指果實即將轉入成熟卻尚未完全成熟的時期，是可以根據常識判斷得出的，如對于枇杷Eriobotrya japonica Lindl.、桃Prunuspersica(L.)Batsch、蘋果Malus pumila Mill和蕓香科Rutaceae的柑桔類等等一般果樹來說是指果皮較綠且果肉較硬的時期。
該方法中與被去掉的柱頭相連的胚珠，由于未完成雙受精過程，不能形成正常的2倍體種子，但在同一朵花中的其他正常發育種子所創造的激素和營養條件的環境下，能誘發孤雌生殖，形成一定頻率的單倍體胚，進而發育成完整的單倍體種子(頻率約為1％以上，遠大于自然發生的頻率)。由于這樣生長出的完整單倍體種子體積遠小于正常種子，又叫“小種子”，該“小種子”內的胚即為單倍體胚，因此非常容易與正常種子相區別。本方法中，去除柱頭、人工授粉、從單倍體種子中取出單倍體胚等單個步驟均能用常規操作方法完成。其中，人工授粉應授予同種植物的花粉，并且所述同種植物的花粉既可以是相同品種的花粉，也可以是不同品種的花粉，也可以是幾個品種的混合花粉。
本發明的第二個目的所提供的植物單倍體胚，是從發育完整的單倍體種子中取得，這些單倍體胚可以使用現有的培養方法培育成為植株，其中的單倍體植株可通過各種常規單倍體檢測方法鑒別。
本發明的第三個目所提供的制備植物單倍體植株的方法，在用于將本發明所提供的制備植物單倍體胚的方法所制備的單倍體胚培養成為單倍體植株的同時，也可以將其他方法制備得到的植物單倍體胚培養成為植株，尤其是適合于對自然生成的單倍體胚的培養。
根據本發明的第三個目的，該制備植物單倍體植株的方法可以采取如下具體方法進行將上述植物單倍體胚直接接種于含有6-BA0.1～0.5mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，IBA0.02～0.1mg/L和0.1～0.5％活性炭的滅菌MS培養基上，置于25±1℃，黑暗條件下培養5～15天(子葉變綠，胚開始萌發)，然后在光照2000±500lux、14～18h/d的條件下，培養約一個月，待其長成完整苗株。隨后，對單倍體枇杷苗株進行煉苗，以適應外界環境。煉苗方法為將培養瓶移到室溫(15～25℃)條件下2～5天，讓培養的單倍體苗逐漸適應外界光照和溫度的變化；然后揭去培養瓶無菌封口膜，使外界空氣進入培養瓶內，使單倍體苗獲得對正常自然條件下微生物的抗性并且適應外界空氣濕度的變化，3～7天后，將枇杷苗從培養瓶內取出。洗凈枇杷苗根上的培養基，移栽于滅菌的珍珠巖與泥炭11混合基質的盆中，置于密封環境條件下，培養過程保持自然光照、100％相對濕度、室溫，每兩周用MS營養液(即MS培養基)施肥一次。1個月后逐漸拆去密封設施，逐漸降低枇杷苗生長環境的相對濕度至自然水平，最后撤去密封設施。
采用常規染色體檢測方法從苗中鑒定出單倍體植株。
本發明制備植物單倍體胚的方法與直接通過組織培養方法離體培養未受精胚囊或胚珠的現有方法相比，優點在于操作簡單、費用低廉、不需要特別的儀器設備和試劑，并且適用面廣、成功率高、能很好地克服植物種屬差異的影響，適用于大田推廣。本發明制備植物單倍體胚的方法能夠使植株單倍體種子產生頻率提高到1％～2％，遠遠地高于自然發生的頻率。本發明單倍體胚對培養條件要求低，更容易培養成苗，苗的生長也更為健康，培養得到的單倍體苗株的移栽存活率可達96％以上。本發明制備植物單倍體植株的方法，在保證培養效果的同時，對儀器設備要求更低、步驟簡便，費用低廉，具有很好的的實際應用前景。
圖1為本發明制備的枇杷單倍體胚的外觀圖，圓圈標注的即為枇杷單倍體胚，圖中標尺的最小刻度為1mm。
圖2為本發明制備的枇杷植株的染色體圖(放大1000倍)，其中圖2A為枇杷單倍體植株的染色體圖，圖2B為枇杷二倍體植株的染色體圖。
具體實施例方式下面通過對本發明較佳實施方式的詳細描述對本發明進行說明。但這種說明不應理解為是對本發明的限制，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變型，只要不脫離本發明的技術思想，均屬于本發明權利要求所定義的范圍。
實施例1單倍體胚的制備1、選取生長良好的枇杷植株20株(品種均為大五星)，隨機分為2組4株為對照組、16株為實驗組，在枇杷即將開花前1-2天，從各植株長勢良好的花序上每花序選取1～4朵球型花(處于這一時期的花尚未開放，花粉尚未成熟，故未發生授粉受精過程)，其余花朵全部摘除。撥開選留的球型花，用眼科剪剪去5個柱頭中的1～4個(隨機剪去1個，或間隔1個柱頭剪掉2～3個，或只保留花中心的一個，剪去4個)。
2、待花瓣開放時(去柱頭2～3天后)，給保留的1～4個柱頭授以足量混合花粉(大五星∶龍泉1號＝1∶1)。
3、摘除未進行人工去除柱頭、授粉的花蕾。讓進行了人工處理的花繼續發育，長出果實，分批疏去發育不正常及多余的果實，最后每個果穗留2～5個果子，以便果實能充分發育。
4、四月初到四月中旬，當枇杷果實直徑2～3cm、表面絨毛蛻去，果實即將轉入成熟卻尚未成熟(果皮為綠色果肉硬)時，將實驗組再均分為A、B、C、D組，在對照組和4個實驗組的每株枇杷處理過的果穗上各隨機采摘100個果實，每組共采摘400個果實，在流水中將果皮洗凈。在超凈工作臺上的無菌條件下，將果實剝開，用無菌的鑷子取出未受精的胚囊(未受精的胚囊直徑2～3mm，扁平狀。而正常種子直徑為1～3cm)，置于無菌培養皿中。用無菌手術刀剝開胚囊，取出單倍體胚。
用公式單倍體胚獲得率＝獲得單倍體胚數/(獲得正常種子數+獲得單倍體胚數)*100％計算單倍體胚獲得率，結果見表1。單倍體胚的外形及大小見圖1。
表1枇杷單倍體胚的制備結果
實施例2單倍體植株的制備將實施例1中由A組所制備的單倍體胚，分別直接接種于滅菌MS培養基上，直接接種于添加6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，IBA 0.1mg/L和0.5％活性炭的滅菌MS培養基上，置于25±1℃黑暗條件下培養15天，25±1℃，光照18h，黑夜6h，1500lux光強下培養成苗(約培養一個月后)。
待長成完整苗株后，對單倍體枇杷進行煉苗，以適應外界環境。煉苗方法為將培養瓶移到室溫(15～25℃)條件下2天，讓培養的單倍體苗逐漸適應外界光照和溫度的變化；然后揭去培養瓶無菌封口膜，使外界空氣進入培養瓶內，使單倍體苗獲得對正常自然條件下微生物的抗性并且適應外界空氣濕度的變化，5天后，將枇杷苗從培養瓶內取出。洗凈枇杷苗根上的培養基，移栽于滅菌的珍珠巖與泥炭1∶1混合基質的盆中，置于封閉環境條件下培養，培養過程保持自然光照、100％相對濕度、25±1℃。每兩周用MS營養液(即MS培養基)施肥一次。1個月后逐漸拆去密封設施，逐漸降低枇杷苗生長環境的相對濕度至自然水平，最后撤去密封設施。
采用常規染色體檢測方法鑒別單倍體苗株和單倍體植株(結果見表2)。單倍體枇杷的染色體圖見圖2A，二倍體枇杷的染色體圖見圖2B。
實施例3單倍體植株的制備將實施例1中由B組所制備的單倍體胚，直接接種于滅菌MS培養基上，直接接種于添加6-BA 0.3mg/L，NAA0.05mg/L，IBA0.05mg/L和0.3％活性炭的滅菌MS培養基上，置于25±1℃黑暗條件下培養7天后，于25±1℃，光照18h，黑夜6h，2000lux光強下培養成苗(約培養一個月后)。
待長成完整苗株后，對單倍體枇杷進行煉苗，以適應外界環境。煉苗方法為將培養瓶移到室溫(15～25℃)條件下3天，讓培養的單倍體苗逐漸適應外界光照和溫度的變化；然后揭去培養瓶無菌封口膜，使外界空氣進入培養瓶內，使單倍體苗獲得對正常自然條件下微生物的抗性并且適應外界空氣濕度的變化，3天后，將枇杷苗從培養瓶內取出。洗凈枇杷苗根上的培養基，移栽于滅菌的珍珠巖與泥炭1∶1混合基質的盆中，置于密封環境條件下培養，培養過程保持自然光照、100％相對濕度、25±1℃。每兩周用MS營養液(即MS培養基)施肥一次。1個月后逐漸拆去密封設施，逐漸降低枇杷苗生長環境的相對濕度至自然水平，最后撤去密封設施。
采用常規染色體檢測方法鑒別單倍體苗株和單倍體植株(結果見表2)。
實施例4單倍體植株的制備將實施例1中由植株C組所制備的單倍體胚，直接接種于添加6-BA 0.1mg/L，NAA 0.01mg/L，IBA 0.02mg/L和0.1％活性炭的滅菌MS培養基上，置于25±1℃黑暗條件下培養5天，于25±1℃，光照14h，黑夜10h，2500lux光強下培養成苗(約培養一個月后)。
待長成完整苗株后，對單倍體枇杷進行煉苗，以適應外界環境。煉苗方法為將培養瓶移到室溫(15～25℃)條件下3天，讓培養的單倍體苗逐漸適應外界光照和溫度的變化；然后揭去培養瓶無菌封口膜，使外界空氣進入培養瓶內，使單倍體苗獲得對正常自然條件下微生物的抗性并且適應外界空氣濕度的變化，4天后，將枇杷苗從培養瓶內取出。洗凈枇杷苗根上的培養基，移栽于滅菌的珍珠巖與泥炭1∶1混合基質的盆中，置于密封環境條件下培養，培養過程保持自然光照、100％相對濕度、25±1℃。每兩周用MS營養液(即MS培養基)施肥一次。1個月后逐漸拆去密封設施，逐漸降低枇杷苗生長環境的相對濕度至自然水平，最后撤去密封設施。
采用常規染色體檢測方法鑒別單倍體苗株和單倍體植株(結果見表2)。
實施例5單倍體植株的制備將實施例1中由D組所制備的單倍體胚，直接接種于添加6-BA0.5mg/L，NAA0.02mg/L，IBA0.02mg/L和0.2％活性炭的滅菌MS培養基上，置于25±1℃黑暗條件下培養7天后(子葉變綠，胚開始萌發)，于25±1℃，光照16h，黑夜8h，2000lux光強下培養成苗(約培養一個月后)。
待長成完整苗株后，對單倍體枇杷進行煉苗，以適應外界環境。煉苗方法為將培養瓶移到室溫(15～25℃)條件下3天，讓培養的單倍體苗逐漸適應外界光照和溫度的變化；然后揭去培養瓶無菌封口膜，使外界空氣進入培養瓶內，使單倍體苗獲得對正常自然條件下微生物的抗性并且適應外界空氣濕度的變化，5天后，將枇杷苗從培養瓶內取出。洗凈枇杷苗根上的培養基，移栽于滅菌的珍珠巖與泥炭1∶1混合基質的盆中，置于密封環境條件下培養，培養過程保持自然光照、100％相對濕度、25±1℃。每兩周用MS營養液(即MS培養基)施肥一次。1個月后逐漸拆去密封設施，逐漸降低枇杷苗生長環境的相對濕度至自然水平，最后撤去密封設施。
采用常規染色體檢測方法鑒別單倍體苗株和單倍體植株(結果見表2)。
用公式單倍體苗株獲得率＝單倍體胚培養所得苗株數/獲得單倍體胚數*100％分別計算A、B、C、D組單倍體苗株獲得率，結果見表2。
用公式單倍體苗株存活率＝移栽存活的單倍體植株數/單倍體胚培養所得苗株數*100％分別計算A、B、C、D組單倍體植株存活率，結果見表2。
表2枇杷單倍體植株的制備結果
上述實例表明本發明制備植物單倍體胚的方法能夠使植株單倍體種子產生頻率提高到1％～2％。遠遠地高于自然發生的頻率。同時本發明方法與直接通過組織培養方法培養未受精胚囊或胚珠以獲得單倍體胚的方法相比的優點在于，采用此方法操作簡單、不需要特別的儀器設備、費用低廉、且成功率高，適用于大田推廣。本發明方法制備得到的單倍體胚更容易培養成苗，單倍體苗株獲得率可達87％以上，苗的生長也極為健康，單倍體苗株的存活率可達96％以上。本發明單倍體植株的制備方法只使用了一種培養基，對儀器設備要求不高、步驟簡便，費用低廉，并且具有很好的實際應用前景。
附MS培養基(Murashige and Skoog medium)配方大量元素二水合氯化鈣(CaCl2)440.0mg/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4)170.0mg/L、硝酸鉀(KNO3)1900.0mg/L、七水合硫酸鎂(MgSO4.7H2O)370.0mg/L、硝酸銨(NH4NO3)1650.0mg/L；微量元素五水合硫酸銅(CuSO4.5H2O)0.025mg/L、鐵鹽(FeNaEDTA)36.7mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、一水合硫酸錳(MnSO4.H2O)16.9mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4.7H2O)8.6mg/L、四水合鉬酸鈉(Na2Mo4.4H2O)0.25mg/L、碘化鉀(KI)0.83mg/L。有機物甘氨酸(Glycine)2.0mg/L、肌醇(Myo-inositol)100mg/L、煙酸(Nicotinic acid)0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L。
IBA吲哚丁酸(indolebutyric acid)NAA萘乙酸(α-naphthaleneacetic acid)6-BA6-芐基嘌呤(6-benzyladenine)
權利要求
1.一種植物單倍體胚的制備方法，它包括以下步驟a、在植物開花前，剪去花中的1～(n-1)個柱頭；b、在花瓣開放時，給保留的柱頭進行人工授粉；c、當植物果實即將轉入成熟時，從未受精的胚囊中取出單倍體胚；步驟a中所述的n為該植物花中的柱頭數。
2.根據權利要求1所述的植物單倍體胚的制備方法，其特征于所述步驟a中，剪去柱頭時，應使保留的柱頭均勻分布。
3.根據權利要求2所述的植物單倍體胚的制備方法，其特征于所述的植物是薔薇科Rosaceae植物。
4.根據權利要求3所述的植物單倍體胚的制備方法，其特征于所述的薔薇科植物是枇杷屬Eriobotrya Lind1植物。
5.采用權利要求1～4任一項所述的方法制備得到的植物單倍體胚。
6.一種植物單倍體植株的制備方法，包括以下步驟a、將權利要求5所述的植物單倍體胚接種于培養基上，培養成苗；b、煉苗，移栽培養得植株。
7.根據權利要求6所述的單倍體植株的制備方法，其特征在于a步驟所述的培養基為含有6-BA 0.1～0.5mg/L，NAA 0.01～0.1mg/L和IBA 0.02～0.1mg/L的MS培養基。
8.根據權利要求7所述的單倍體植株的制備方法，其特征在于a步驟所述的培養基為含有6-BA0.5mg/L，NAA0.02mg/L和IBA0.02mg/L的MS培養基。
9.根據權利要求7或8所述的單倍體植株的制備方法，其特征在于a步驟所述的培養基還含有0.1～0.5％的活性炭。
10.根據權利要求6～9任一項所述的單倍體植株的制備方法，其特征在于a步驟的培養條件為溫度25±1℃，黑暗條件下培養5～15天，然后在光照2000±500lux、14～18h/d的條件下，培養一個月。
全文摘要
本發明提供了一種植物單倍體胚及單倍體植株的制備方法，屬于植物栽培領域，該植物單倍體胚的制備方法包括以下步驟a.在植物開花前，剪去花中的1～3個柱頭；b.在花瓣開放時，給保留的柱頭進行人工授粉；c.當植物果實即將轉入成熟時，從未受精的胚囊中取出單倍體胚。本發明植物單倍體植株的制備方法包括以下步驟a.將制備得到的單倍體胚接種于培養基上，培養成苗；b.煉苗，移栽培養。本發明方法優點在于操作簡單、不需要特別的儀器設備、費用低廉、且成功率高，適用于大田推廣，具有很好的實際應用前景。
文檔編號A01H4/00GK1799332SQ20051002248
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月31日 優先權日2005年12月31日
發明者王永清, 李俊強, 鄧群仙, 侯春霞, 周蘭英, 王小蓉, 陳紅 申請人:四川農業大學