一種小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方及制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方及制備方法，該配方由以下化合物和對應的用量配制而成：2，4-二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖35-45g/L、磷酸二氫鉀2-4g/L、亞硫酸6-8ml/L、四硼酸鈉0.5-1.5g/L、碳酰二胺2-4g/L、硝酸銀8-10mg/L。該配方配制的培養液，用于培養授過玉米花粉、從盆缽或田間剪回室內的小麥穗，誘導產生小麥單倍體胚；在所有其它條件不改變的情況下，改用該配方后單倍體胚的誘導率可比用現有的穗培養液再提高10-15個百分點。
【專利說明】一種小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業生物化學【技術領域】，涉及一種小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方及制備方法。
【背景技術】
[0002]Zenkteler (1984)、Laurie等(1986)建立的玉米花粉誘導小麥單倍體技術,通過20多年的研究，目前已成為產生小麥單倍體效率最高的途徑之一。小麥單倍體在篩選基因突變體、基因功能研究等方面具有重要應用價值，加倍單倍體在基因定位、構建連鎖遺傳圖譜、固定雜種優勢、加速小麥育種進程等方面具有重要應用價值。
[0003]單倍體胚誘導率，也稱成胚率、得胚率，是指用玉米花粉每授粉100個去雄的小麥小花能得到的小麥單倍體胚個數，它是判斷小麥玉米雜交單倍體胚誘導效率的主要技術指標，也是決定該單倍體胚誘導技術能否在小麥育種上應用的關鍵指標之一。單倍體胚誘導率受小麥基因型、玉米基因型、玉米花粉的質量、激素處理方法、授粉后的生長條件(包括自然條件和營養條件)等多種因素的影響。目前絕大多數報道的單倍體胚誘導率只有15% -25%，成本較高，只是在極少數小麥材料上可達到30% -40%，個別材料最高為59%，單倍體胚誘導率不穩定，時低時高。因此獲得較高而且穩定的單倍體胚誘導率，是小麥玉米雜交單倍體胚誘導技術在小麥育種上廣泛應用必須解決的關鍵問題之一ο Riera-Lizarazu (1992)、Suenaga (1997)、Inagaki (1997)、Cherkaoui (2000)、Inagaki (1997,1998 )、Mujeeb-Kazi (2006)、Muhammad Ahsan Khan (2011)、MakhdoomHussain(2012)等將授過玉米花粉的麥穗剪回室內插在穗培養液中并置于室內人工控制的溫度、濕度、光照條件下進行離體培養，最大限度地減少了外界復雜多變的自然因素對單倍體胚誘導、發育的影響，較好地解決了單倍體胚誘導率的穩定性問題，但大多數小麥材料的單倍體胚誘導率較低的問題仍未解決。
[0004]離體培養時，由于麥穗在脫離母體植株后還要繼續生長13天以上，在此期間要保證麥穗維持正常的生理生化功能，產生更多的單倍體胚、保證單倍體胚不夭亡，穗培養液是其最主要的外部營養來源，因此穗培養液的質量至關重要。
[0005]在世界絕大多數地區，小麥和玉米兩種作物都不能同季種植，小麥在冬春季節種植，而玉米則在春夏季種植，給該技術的進一步研究完善帶來諸多不便。而云南多數地區的夏季，春性、弱春性、半冬性小麥與玉米都可在夏季同季種植，為研究完善該技術提供了便利條件。2000年以來我們利用云南的自然優勢開展了 60余項試驗研究，也報道了一些研究結果，包括高誘導率玉米基因型、高效授粉方法和激素處理方法、改進的穗培養液配方等。關于穗培養液配方，2008年我們用自主改進配方(2，4-D100mg/L+蔗糖40g/L+硝酸銀10mg/L+亞硫酸8ml/L+磷酸二氫鉀3g/L)與國內外報道的以下3種主要穗培養液配方進行了比較研究:
[0006]配方A:2,4_D100mg/L+鹿糖 40g/L+亞硫酸 8ml/L(Inagaki, 1997 ;蔡華等，2005 ；Mujeeb-Kazi, 2006 ；Muhammad Ahsan Khan,2011 ；Makhdoom Hussain,2012)；
[0007]配方B:2,4-D100mg/L+ 鹿糖 40g/L+ 硝酸銀 10mg/L+ 亞硫酸 8ml/L(Inagaki,1998)；
[0008]配方C:2,4_D100mg/L+鹿糖 40g/L+乙醇 10ml/L(Najia Saidi, 1997 ；Cherkaoui,2000)
[0009]結果自主改進配方的單倍體胚誘導率基本穩定在30%左右(加權平均31.35%),優于其他3種配方，其中用配方C在兩年兩個試驗點的單倍體胚誘導率均為0，詳細結果見《麥類作物學報》2008年第I期第1-5頁。
【發明內容】
[0010]為了克服現有技術中存在的缺陷，本發明提供一種小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方及制備方法，涉及高頻率誘導小麥產生單倍體胚，該單倍體胚通過胚培養，可產生小麥單倍體苗，對單倍體苗進行染色體加倍，可獲得加倍單倍體(Doubledhaploid,簡稱DH)植株。其技術方案如下:
[0011]一種小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方，該配方由以下化合物和對應的用量配制而成:2，4-二氯苯氧乙酸(別名2，4-D)100mg/L、蔗糖35-45g/L、磷酸二氫鉀 2-4g/L、亞硫酸 6-8ml/L、四硼酸鈉 0.5-1.5g/L、碳酰二胺 2_4g/L、硝酸銀 8-lOmg/L。
[0012]進一步優選，該配方由以下化合物和對應的用量配制而成:2，4_ 二氯苯氧乙酸100mg/L、鹿糖40g/L、磷酸二氫鉀3g/L、亞硫酸8ml/L、四硼酸鈉1.0g/L、碳酰二胺3g/L、硝酸銀9mg/L。
[0013]進一步優選，用該配方配制培養液時，所用水的最低質量要求為符合國家《生活飲用水衛生標準》(GB5749-2006)的自來水；所用蔗糖、磷酸二氫鉀、亞硫酸、四硼酸鈉、碳酰二胺的最低純度要求為化學純；所用2，4-二氯苯氧乙酸和硝酸銀的純度要求為分析純。
[0014]進一步優選，所述麥穗離體培養液配制完成后需盛于深色容器保存備用。
[0015]本發明所述的小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方的制備方法，包括以下步驟:
[0016](I)稱取IOOmg的2，4-二氯苯氧乙酸于燒杯，加入60ml濃度為0.1N的氫氧化鈉，用玻棒或攪拌器攪拌，使2,4- 二氯苯氧乙酸完全溶解；
[0017](2)用容量為1000ml的容器量取600ml自來水，按權利要求1所述配方中各化合
物的用量，依次加入蔗糖、磷酸二氫鉀、四硼酸鈉、碳酰二胺、亞硫酸、硝酸銀，和已溶解的2，
4-二氯苯氧乙酸；
[0018](3)加自來水定容到1000ml，搖勻，倒入深色容器常溫保存備用。
[0019]本發明所述的小麥單倍體胚是指通過玉米花粉給普通小麥授粉的途徑來誘導小麥產生的未進行人工染色體加倍的單倍體胚；
[0020]本發明所述的麥穗離體培養是指從田間或盆缽中剪取授過玉米花粉的麥穗插入盛有穗培養液的器皿中在室內進行晝夜連續培養。
[0021]與現有技術相比，本發明的有益效果:用該配方培養的麥穗，到培養結束的14天，莖、葉、穗仍保持綠色，即仍能維持正常的生理生化功能，且穎果結實率高，發育飽滿；相比之下自主改進配方到此時莖、葉、穗已基本變黃，說明到培養結束前幾天其莖、葉、穗的生理生化功能已開始衰退。因此利用本發明提供的新培養液配方，在其它條件不改變的情況下，其單倍體胚誘導率比用此前的自主改進配方平均至少提高了 5個百分點，比國內外報道的其它配方平均至少提高了 10個百分點，這在批量生產小麥加倍單倍體中，可進一步提高效率，降低成本。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術方案。
[0023]實施例1:
[0024]本發明穗培養液配方(P):2，4-D100mg/L+蔗糖35g/L+磷酸二氫鉀2g/L+亞硫酸6ml/L+四硼酸鈉0.5g/L+碳酰二胺2g/L+硝酸銀8mg/L。
[0025]對照穗培養液配方(C):2,4-D100mg/L+鹿糖40g/L+硝酸銀10mg/L+亞硫酸8ml/L，配方來自于期刊 Euphytica (1998，104: 17-23)。
[0026]培養液的配制:(1)稱取IOOmg的2,4_ 二氯苯氧乙酸于燒杯，加入50ml濃度為0.1N的氫氧化鈉，用玻棒或攪拌器攪拌，使2，4_ 二氯苯氧乙酸完全溶解；(2)向容量為1000ml的容量瓶中加入600ml自來水，然后依次加入蔗糖35g、磷酸二氫鉀2g、四硼酸鈉
0.5g、碳酰二胺2g、亞硫酸6ml、硝酸銀8mg和已溶解的2,4- 二氯苯氧乙酸；(3)補充自來水定容到1000ml，搖勻后倒入深色容器常溫保存備用。對照穗培養液的配制只是在(2)中加入的化合物種類、用量不同，其他均相同。
[0027]小麥玉米雜交麥穗的離體培養:按照《麥類作物學報》2008年第I期第1-5頁論文“小麥玉米雜交誘導小麥單倍體的割穗離體培養研究”所述的方法進行。2009年7月12日的對比試驗中，將授過玉米花粉的3個不同小麥材料Al (云麥52號)、A2 (云麥101)、A3 (01Y1-608)共30個麥穗沿植株地表從田間剪回，每個小麥材料的10個麥穗分為兩組，每組5穗，分別插入本發明配方配制的培養液⑵和對比培養液(C)培養14天(至2009年7月26日)，取穗，剝取穎果(籽粒)，在解剖鏡下剝胚，統計每個處理的單倍體胚個數。試驗結果如下:
[0028]AlP:總授粉小花數154個，結實穎果數151個，單倍體胚62個，誘導率為40.26%
[0029]AlC:總授粉小花數156個，結實穎果數124個，單倍體胚42個，誘導率為26.92%
[0030]A2P:總授粉小花數167個，結實穎果數160個，單倍體胚54個，誘導率為32.34%
[0031]A2C:總授粉小花數159個，結實穎果數132個，單倍體胚28個，誘導率為17.61%
[0032]A3P:總授粉小花數149個，結實穎果數139個，單倍體胚54個，誘導率為36.24%
[0033]A3C:總授粉小花數146個，結實穎果數120個，單倍體胚28個，誘導率為19.18%
[0034]總平均:本發明配方(P)配制的培養液共培養15穗，授粉小花數470個，共獲得單倍體胚170個，單倍體胚誘導率為36.17% ;對照配方(C)配制的培養液共培養15穗，授粉小花數461個，共獲得單倍體胚98個，單倍體胚誘導率為21.26%。本發明培養液的單倍體胚誘導率平均比對照高14.91個百分點。
[0035]實施例2:
[0036]穗培養液配方(P):2 ,4-D100mg/L+鹿糖45g/L+磷酸二氫鉀4g/L+亞硫酸8ml/L+四硼酸鈉1.5g/L+碳酰二胺4g/L+硝酸銀10mg/L。
[0037]對照(C)穗培養液配方:2,4-D100mg/L+鹿糖40g/L+硝酸銀10mg/L+亞硫酸8ml/L+磷酸二氫鉀3g/L，配方引自《麥類作物學報》，2008，28 (I):1_5。
[0038]兩個培養液的配制方法同實施例1。
[0039]小麥玉米雜交麥穗的離體培養:2011年8月7日的對比試驗中，將授過玉米花粉的2個小麥不育系K78S(S1)和K456S(S2)共24個麥穗從田間剪回室內，每個小麥材料的12個麥穗分為兩組,每組6穗,分別插入本配方配制的培養液(P)和對照培養液(C)培養14天(至2011年8月21日)，取穗，剝取穎果(籽粒)，在解剖鏡下剝胚，統計每個處理的單倍體胚個數。試驗結果如下:
[0040]SlP:總授粉小花數237個，結實穎果數221個，單倍體胚91個，誘導率為38.40%
[0041]SlC:總授粉小花數234個，結實穎果數223個，單倍體胚71個，誘導率為30.34%
[0042]S2P:總授粉小花數255個，結實穎果數249個，單倍體胚84個，誘導率為32.94%
[0043]S2C:總授粉小花數259個，結實穎果數254個，單倍體胚72個，誘導率為27.80%
[0044]總平均值:本發明配方配制的培養液(P)共培養12穗，授粉小花數492個，共獲得單倍體胚175個，單倍體胚誘導率為35.57% ;對照配方配制的培養液(C)共培養12穗，授粉小花數493個，共獲得單倍體胚143個，單倍體胚誘導率為29.01%。本發明培養液的單倍體胚誘導率平均比對照高6.56個百分點。
[0045]實施例3:
[0046]穗培養液配方 (P):2,4-D100mg/L+鹿糖40g/L+磷酸二氫鉀3g/L+亞硫酸7ml/L、四硼酸鈉1.0g/L、碳酰二胺3g/L、硝酸銀9mg/L。培養液的配制方法同實施例1。
[0047]小麥玉米雜交麥穗的離體培養:2012年7月22日將授過玉米花粉的15個小麥不育系材料(S1-S15)共156個麥穗從田間剪回室內插入本配方配制的培養液中培養14天(至2012年8月5日)，取穗，剝取穎果(籽粒)，在解剖鏡下剝胚，統計每個不育系材料的單倍體胚個數。試驗結果如下:
[0048]SI:12穗，總授粉小花數459個，結實穎果數453個，單倍體胚180個，誘導率為39.2%
[0049]S2:15穗，總授粉小花數611個，結實穎果數574個，單倍體胚169個，誘導率為27.7%
[0050]S3:12穗，總授粉小花數493個，結實穎果數462個，單倍體胚96個，誘導率為19.5%
[0051]S4:11穗，總授粉小花數433個，結實穎果數425個，單倍體胚95個，誘導率為21.9%
[0052]S5:9穗，總授粉小花數325個，結實穎果數321個，單倍體胚116個，誘導率為35.7%
[0053]S6:10穗，總授粉小花數402個，結實穎果數371個，單倍體胚個177，誘導率為
44.0%
[0054]S7:14穗，總授粉小花數505個，結實穎果數487個，單倍體胚207個，誘導率為41.0%
[0055]S8:8穗，總授粉小花數個304，結實穎果數285個，單倍體胚107個，誘導率為35.2%
[0056]S9:5穗，總授粉小花數226個，結實穎果數個211，單倍體胚53個，誘導率為23.4%
[0057]SlO:10穗，總授粉小花數384個，結實穎果數365個，單倍體胚137個，誘導率為
35.7%
[0058]Sll: 11穗，總授粉小花數444個，結實穎果數個430，單倍體胚142個，誘導率為32.0%
[0059]S12:12穗，總授粉小花數469個，結實穎果數個461，單倍體胚205個，誘導率為43.7%
[0060]S13:7穗，總授粉小花數295個，結實穎果數個283，單倍體胚109個，誘導率為
36.9%
[0061]S14:10穗，總授粉小花數363個，結實穎果數個352，單倍體胚136個，誘導率為
37.5%
[0062]S15:10穗，總授粉小花數357個，結實穎果數個343，單倍體胚132個，誘導率為36.9%
[0063]以上15個小麥不育系材料共計培養156穗，總授粉小花數6070個，共獲得單倍體胚2061個，單倍體胚誘導率為33.9%。
[0064]以上所述，僅為本發明最佳實施方式，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術范圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方，其特征在于，該配方由以下化合物和對應的用量配制而成:2，4_ 二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖35-45g/L、磷酸二氫鉀2-4g/L、亞硫酸 6-8ml/L、四硼酸鈉 0.5-1.5g/L、碳酰二胺 2_4g/L、硝酸銀 8-lOmg/L。
2.根據權利要求1所述的小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方，其特征在于，該配方由以下化合物和對應的用量配制而成:2，4- 二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖40g/L、磷酸二氫鉀3g/L、亞硫酸8ml/L、四硼酸鈉1.0g/L、碳酰二胺3g/L、硝酸銀9mg/L。
3.根據權利要求1所述的小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方，其特征在于，用該配方配制培養液時，所用水的最低質量要求為符合國家《生活飲用水衛生標準》GB5749-2006的自來水；所用蔗糖、磷酸二氫鉀、亞硫酸、四硼酸鈉、碳酰二胺的最低純度要求為化學純；所用2，4- 二氯苯氧乙酸和硝酸銀的純度要求為分析純。
4.根據權利要求1所述的小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方，其特征在于，所述麥穗離體培養液配制完成后需盛于深色容器保存備用。
5.一種權利要求1所述的小麥玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗離體培養液配方的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)稱取IOOmg的2，4-二氯苯氧乙酸于燒杯，加入60ml濃度為0.1N的氫氧化鈉，用玻棒或攪拌器攪拌，使2,4-二氯苯氧乙酸完全溶解； (2)用容量為1000ml的容器量取600ml自來水，按權利要求1所述配方中各化合物的用量，依次加入蔗糖、磷酸二氫鉀、四硼酸鈉、碳酰二胺、亞硫酸、硝酸銀，和已溶解的2，4-二氯苯氧乙酸； (3)加自來水定容到1000ml，搖勻，倒入深色容器常溫保存備用。
【文檔編號】A01H4/00GK103782907SQ201410000309
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】楊木軍, 顧堅, 李紹祥, 劉琨, 李宏生, 田玉仙, 趙紅, 楊和仙, 丁明亮 申請人:云南省農業科學院糧食作物研究所