專利名稱：甜葉菊同源四倍體植株的培育方法
技術領域：
本發明涉及一種植物新品種的培育方法，具體來說是涉及一種糖料作物甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，屬于生物技術育種領域。
背景技術：
甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)為雙子葉植物綱菊科斯臺維亞屬多年生草本植物，原產南美巴拉圭阿曼拜山脈，當地居民把它作為甜茶飲用已經有一百年的歷史，是一種新型的糖料作物。甜葉菊葉片中含有甜味成分甜菊糖苷，其甜度為蔗糖的250 300 倍，且無毒、高甜度、低熱量、無副作用。甜葉菊具有較高的經濟價值，于1976年在我國引種成功，近年來常規育種為甜葉菊品種改良做了較多試驗，隨著生物技術的發展，為品種改良和種質創新又增加了新的可行方法。如果能在離體快繁條件下利用誘變劑秋水仙素對甜葉菊進行同源四倍體誘導，不僅可提高產量和質 量，同時還創新了種質資源。植物染色體組多倍化是植物進化的一個重要標志。由二倍體誘導形成的同源四倍體具有器官巨大性、活性成分含量提高、抗逆性增強、育性降低等顯著特征。自上世紀30 年代開始，我國在多倍體育種方面獲得較大成功，如糧食作物小麥、黑麥、水稻；蔬菜作物蘿卜、番茄、不結球白菜、茄子等；果樹中的葡萄、獼猴桃、香蕉；藥用植物中的百合、黃芩、枸
杞、桔梗、鐵皮石斛等；經濟作物亞麻、甜菜、煙草、牧草等，多倍體的應用非常廣泛。關于甜葉菊多倍體誘導方面的研究僅1995年陳紹潘利用實生苗點滴法獲得同源四倍體，易受外界影響。
發明內容
本發明的目的在于針對現有甜葉菊中甜菊糖苷含量低的問題，根據植物細胞染色體加倍后，其基因劑量倍增使植物的新陳代謝增強，染色體上基因調控的有效化學成分含量往往較二倍體高，同時多倍體植物具有器官巨大性的特征而提供一種甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，可短期內培育出有效成分(甜菊糖苷)含量較高的甜葉菊同源四倍體植株，以滿足人們在食品和醫藥工業中對甜菊糖苷類甜味成分的需求。本發明以甜葉菊不定芽作為誘變材料，采用秋水仙素溶液與組織培養技術相結合的方法，進行多倍體誘導培養， 獲得較高的誘導率并在短期內得到大量的四倍體組培苗。本發明甜葉菊同源四倍體植株的培育方法通過以下技術方案來實現甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，該方法利用濃度為0. 5g/L 2. Og/L的秋水仙素溶液浸泡甜葉菊不定芽12 48h，用無菌水清洗后接種在MS培養基中，培養20 30 天獲得變異幼苗，再將幼苗接種到生根培養基中，待根長至2 3cm。上述方法具體包括以下步驟將不定芽浸泡在加入2% 二甲基亞砜的濃度為
0.5g/L 2. Og/L秋水仙素溶液中，處理12 48h，浸泡后的不定芽用無菌水沖洗3 4次， 吸干水接種到MS培養基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度23 25 °C的環境條件下培養20 30天，得到長3 4cm變異幼苗，將幼苗接種到生根培養基中進行生根培養，待根長至2 3cm。該方法所述的生根培養基的組成為1/2MS 培養基
萘乙酸(NAA)0 .05 0.10mg/L
吲哚乙酸(IBA)0.05 0.10mg/L
瓊脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.5-5.8不定芽的獲得包括以下步驟選取甜葉菊植株的嫩芽，滅菌后接種到誘導培養基中，培養溫度23 25°C，每日光照12h，光照度1500 2000Lx，培養15 20天，誘導出不定芽。所述的滅菌方法是將甜葉菊植株的嫩芽先用洗衣粉洗凈，再用流動的清水沖洗I 2h，用75%酒精浸泡30S，無菌水沖洗2 3次之后放入O. 10%的升汞溶液中浸泡5 8min，用無菌水沖洗3 4次。所述的誘導培養基的組成為MS培養基
6-芐基腺嘌呤(6-BA)0.20 0.30mg/L
激動素(KT)0.10 0.20mg/L
萘乙酸(NAA)0.01 0.05mg/L
瓊脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.5-5.8本發明甜葉菊同源四倍體植株的培育方法具體包括以下步驟A、不定芽的獲得取甜葉菊植株的嫩芽，先用洗衣粉洗凈再用流動的清水沖洗I 2h。用75%酒精浸泡30S，無菌水沖洗2 3次之后放入O. 10%的升汞溶液中浸泡5 8min，用無菌水沖洗3 4次，將滅菌后的嫩芽接種到下列誘導培養基中MS培養基
6-芐基腺嘌呤(6-BA)0.20 0.30mg/L
激動素(KT)0.10 0.20mg/L
萘乙酸(NAA)0.01 0.05mg/L
瓊脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.5-5.8
以日光燈為光源，光照度1500 2000LX，每天光照12h，溫度(24±1) °〇的環境條件下培養15 20天，誘導出不定芽。B、甜葉菊同源四倍體誘導將不定芽浸泡在濃度為0. 5 2. Og/L秋水仙素溶液 (加入2%二甲基亞砜)中，處理12 48h，浸泡后的不定芽用無菌水沖洗3 4次，吸干水接種到MS培養基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度23 25°C的環境條件下培養20 30天，得到長3 4cm變異幼苗，將幼苗接種到以下生根培養基中進行生根培養1/2MS 培養基
萘乙酸(NAA)0.05 0.10mg/L
吲哚乙酸(IBA)0.05 0.10mg/L
瓊脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.5-5.8培養室以日光燈為光源，光照度1500 2000LX，每天光照12h，溫度23 25°C的環境條件下培養20 30天，待根長至2 3cm。將確定為四倍體的植株還可以擴繁移栽，具體包括以下步驟將確定為四倍體的植株切成莖段接種到上述誘導培養基內，待不定芽長至2 3cm，將其轉入上述生根培養基中生根培養，苗高3 4cm，根長約2 3cm時進行煉苗移栽。所述的煉苗為打開瓶蓋先在培養室煉苗2 3d，使嫩苗逐漸與外界接觸，提高適應能力，再在溫室中煉苗2 3d后洗凈根部的培養基，栽到由泥炭蛭石珍珠巖=2 I I的基質中。甜葉菊同源四倍體植株煉苗移栽成活率達75%以上。本發明鑒定染色體數目為四倍體植株的方法如下根尖染色體計數待根長至2cm左右，切取約Icm的根尖用水洗凈。按照以下步驟進行染色體鑒定。預處理0. 002mol/L8-羥基喹啉溶液10 20°C處理4 6h ;固定卡諾氏固定液(無水乙醇冰醋酸=3 1)4°C固定24h;前低滲0.075mol/LKCL浸泡20 30min ;解離lmol/LHCL60°C水浴中解離10 12min ;后低滲蒸餾水浸泡30min ;染色制片切取Imm根尖置于載玻片中央加卡寶品紅I滴染色，IOmin后蓋上蓋玻片，壓片鏡檢并拍照。統計甜葉菊染色體條數，染色體數目2n = 2X2x = 2X22 = 44為四倍體植株。流式細胞術鑒定法采集經根尖染色體技術確定為四倍體植株葉片3 4片葉片， 用濾紙吸干水，置于干凈的玻璃培養皿中。加入0. 5mL預冷的組織解離液用鋒利的刀片迅速將葉片切碎，200目尼龍網過濾，1000r/min離心5m in，漂洗3次。加入DAPI染液2. OmL， 室溫下靜置反應3min。用移液器吸出組織解離混合液，通過PARTEC流式細胞儀專用的過濾漏斗濾至上樣管中。以二倍體植株為對照，調整GAIN值使峰值位于100處后，檢測其他變異植株，峰值位于200處即為四倍體。圖形中的橫坐標表示NDA含量多少；縱坐標表示細胞數量。流式細胞術鑒定法中解離液和染液組 成如下(I)組織解離液Tris15mmol/LNa2EDTA 20 mmol/LKCl 80 mmol/LNaCl 20 mmol/L
TritonX-1000.1% (v/v)
β巰基乙醇 0.117% (v/v)pH 7. 5，_20°C保存 ，用時解凍并于4°C下臨時保存⑵DAPI 染液1)PBS緩沖液的配制
NaCl 137mmol/L KCl 2.7mmol/L Na2HP04 4.3mmol/L
KH2PO4 IAmmolfLpH7. 2 74，0. 22 μ m濾膜過濾除菌后4°C保存2) DAPI染液的配制用70%乙醇配制DAPI貯存液，濃度為10 μ g/mL。用錫箔紙包好，于_20°C凍存。使用時用PBS緩沖液以I : 1000體積比稀釋，最終濃度100ng/ml。注意DAPI有強烈致癌作用，操作時應戴上手套。與現有技術比較本發明的有益效果與常規誘變方法相比，離體條件下誘導多倍體不受季節等環境條件的影響，誘導條件容易控制；可反復大量地處理不定芽；所選材料幼嫩容易被秋水仙素影響，誘導率較高；用試管苗進行根尖染色體鑒定比大田中更方便，提高了工作效率。本發明在離體條件下以甜葉菊不定芽作為誘變材料，采用秋水仙素溶液與組織培養技術相結合的方法，進行多倍體誘導培養，結果表明，通過該方法獲得較高的誘導率并在短期內得到大量的四倍體組培苗，獲得的甜葉菊同源四倍體組培苗節間較二倍體短，葉色深，葉片大而厚，已初步體現了多倍體在形態學上得優勢。而且，隨著秋水仙素濃度升高和處理時間延長，死亡率(培養20 30d后不定芽變褐色即為死亡)和誘導率均增力口。經實驗篩選用O. 5g/L 2. Og/L秋水仙素溶液浸泡不定芽12 48h,死亡率為10% 30%，多倍體誘導率為12% 32. 14%，為合適范圍。而2. Og/L秋水仙素溶液處理12h的效果最好，誘導率為32. 14%，死亡率為30%。
圖I為甜葉菊二倍體及同源四倍體植株根尖染色體數目鏡檢結果圖。其中a為甜葉菊二倍體植株根尖染色體數目(2n = 2x = 22)b為甜葉菊同源四倍體植株根尖染色體數目(2n = 4x = 44)圖中，顯示甜葉菊二倍體及同源四倍體植株根尖染色體數目，采用根尖染色體計數，統計根尖細胞有絲分裂中期染色體數目。由圖I可知甜葉菊二倍體植株(對照)根尖染色體數目2n = 2x = 22(a);甜葉菊同源四倍體植株根尖染色體數目為對照的2倍，即染色體數目2n = 2 X 2x = 2 X 22 = 44為四倍體植株(b)。圖2為甜葉菊二倍體及同源四倍體植株葉片DNA含量圖。其中，a為二倍體植株葉片DNA含量b為四倍體植株葉片DNA含量使用流式細胞儀采用流式細胞術鑒定法測變異植株倍性，以二倍體植株為對照，圖形中的橫坐標表示突光強度即DNA相對含量；縱坐標表示細胞數量。二倍體DNA相對含量在100處有一個單峰，變異植株DNA相對含量在200處有一個單峰，是對照的2倍，說明是四倍體。
具體實施例方式為了更好地說明本發明的實質內容，下面列出本發明的實施例，但本發明的內容并不僅限于此。實施例I(I)不定芽的獲得選取甜葉菊植株的健壯嫩芽，先用洗衣粉洗凈再用流動的清水沖洗2h，用75%酒精浸泡30S，無菌水沖洗2 3次之后放入O. 10%的升汞溶液中浸泡5min，用無菌水沖洗3 4次，將滅菌后的嫩芽接種到下列誘導培養基中MS培養基
6-芐基腺嘌呤(6-BA) 0.30mg/L 激動素(KT)0.20mg/L
萘乙酸(NAA)0.05mg/L
瓊脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.8培養室以日光燈為光源，光照度1500LX，每天光照12h，溫度(24±1)°C的環境條件下培養20天，誘導出大量不定芽。(2)甜葉菊同源四倍體誘導將不定芽浸泡在濃度為O. 5g/L秋水仙素溶液(加入2%二甲基亞砜)中，處理12 48h，每個處理浸泡30個不定芽。浸泡后的不定芽用無菌水沖洗3 4，濾紙吸干水接種到MS培養基中，在光照度1500LX，每天光照12h，溫度(24 ± I) °C的環境條件下培養20天，得到長至3 4cm變異幼苗，將長至3 4cm的幼苗接種到以下生根培養基中進行生根培養1/2MS 培養基萘乙酸(NAA)0.10mg/L
吲哚乙酸(IBA)O.lOmg/L
瓊脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.8 生根培養培養室以日光燈為光源，光照度1500LX，每天光照12h，溫度23 25°C的環境條件下培養20天，待根長至2 3cm ;(3)根尖染色體計數切取約Icm的根尖用水洗凈，按照以下步驟進行染色體鑒定。預處理0. 002mol/L8-羥基喹啉溶液15°C處理4h ;固定卡諾氏固定液(無水乙醇 冰醋酸=3 1)4°C 固定 12h ;前低滲:0. 075mol/LKCL 浸泡 20min ;解離lmol/LHCL60°C水浴中解離IOmin ;后低滲蒸餾水浸泡20min ;染色制片切取Imm根尖置于載玻片中央加卡寶品紅I滴染色，IOmin后蓋上蓋玻片，壓片鏡檢并拍照。統計甜葉菊染色體條數，染色體數目2n = 2X2x = 2X22 = 44為四倍體植株。(4)流式細胞術鑒定法采集經根尖染色體技術確定為四倍體植株葉片3-4片葉片，用濾紙吸干水，置于干凈的玻璃培養皿中。加入0. 5mL預冷的組織解離液用鋒利的刀片迅速將葉片切碎，200目尼龍網過濾，1000r/min離心5min，漂洗3次。加入DAPI染液2. OmL, 室溫下靜置反應3min。用移液器吸出組織解離混合液，通過PARTEC流式細胞儀專用的過濾漏斗濾至上樣管中。圖形中的橫坐標表示NDA含量多少；縱坐標表示細胞數量。以二倍體植株為對照，調整GAIN值使峰值位于100處后，檢測其他變異植株，峰值位于200處即為四倍體。(5)擴繁移栽將確定為四倍體的植株切成莖段接種到I步驟中的誘導不定芽培養基內。待不定芽長至2 3cm左右，將其轉入生根培養基中生根培養，苗高3 4cm，根長約2 3cm時即可進行煉苗移栽。煉苗時打開瓶蓋先在培養室煉苗2d，使嫩苗逐漸與外界接觸，提高適應能力。然后在溫室中煉苗3d后洗凈根部的培養基栽到基質(泥炭蛭石 珍珠巖=2 : I : I)中。甜葉菊同源四倍體植株煉苗移栽成活率達85%。在此實例中處理不定芽120個，不定芽死亡率為10%，多倍體誘導率為12.00%， 共獲得甜葉菊同源四倍體植株7株組培苗。實施例2(I)不定芽的獲得選取甜葉菊植株的健壯嫩芽，先用洗衣粉洗凈再用流動的清水沖洗I. 5h。用75%酒精浸泡30S，無菌水沖洗2 3次之后放入0. 10%的升汞溶液中浸泡6min，用無菌水沖洗3 4次。將滅菌后的莖段接種到誘導培養基:MS培養基+0. 2mg/ L6-BA+0. lmg/L KT+0. 01mg/LNAA+6500mg/L 瓊脂+30000mg/L 蔗糖中，PH 5.6。培養室以日光燈為光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度(24±1) °C的環境條件下培養15 天，誘導出大量不定芽。(2)甜葉菊同源四倍體誘導將不定芽浸泡在濃度為I. Og/L秋水仙素溶液(力口入2%二甲基亞砜)中，處理12 48h，每個處理浸泡30個不定芽。浸泡后的不定芽用無菌水沖洗3 4次，濾紙吸干水接種到MS基本培養基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度(24 ± I) °C的環境條件下培養30天，得到變異幼苗。將長至3 4cm的幼苗接種到培養基 1/2MS 培養基 +0. 05mg/LNAA+0. 05mg/L IBA+6500mg/L 瓊脂 +30000mg/L 蔗糖，PH5. 6中進行生根培養，生根培養培養室以日光燈為光源，光照度1500Lx，每天光照12h，溫度23 25°C的環境條件下培養15天，待根長至2 3cm。
(3)根尖染色體計數切取約Icm的根尖用水洗凈，按照以下步驟進行染色體鑒定。預處理0.002mol/L8-羥基喹啉溶液15°C處理5h ;固定卡諾氏固定液(無水乙醇冰醋酸=3 1)4°C 固定 24h ;前低滲0. 075mol/LKCL 浸泡 30min ;解離lmol/LHCL60°C水浴中解離12min ;后低滲蒸餾水浸泡30min ;染色制片切取Imm根尖置于載玻片中央加卡寶品紅I滴染色，IOmin后蓋上蓋玻片，壓片鏡檢并拍照。統計甜葉菊染色體條數，染色體數目2n = 2X2x = 2X22 = 44為四倍體植株。(4)流式細胞術鑒定法采集經根尖染色體技術確定為四倍體植株葉片3-4片葉片，用濾紙吸干水，置于干凈的玻璃培養皿中。加入O. 5mL預冷的組織解離液用鋒利的刀片迅速將葉片切碎，200目尼龍網過濾，1000r/min離心5min，漂洗3次。加入DAPI染液2. OmL,室溫下靜置反應3min。用移液器吸出組織解離混合液，通過PARTEC流式細胞儀專用的過濾漏斗濾至上樣管中。圖形中的橫坐標表示NDA含量多少；縱坐標表示細胞數量。以二倍體植株為對照，調整GAIN值使峰值位于100處后，檢測其他變異植株，峰值位于200處即為四倍體。(5)擴繁移栽將確定為四倍體的植株切成莖段接種到I步驟中的誘導不定芽培養基內。待不定芽長至2 3cm左右，將其轉入生根培養基中生根培養，苗高3 4cm，根長約2 3cm時即可進行煉苗移栽。煉苗時打開瓶蓋先在培養室煉苗3d，使嫩苗逐漸與外界接觸，提高適應能力。然后在溫室中煉苗3d后洗凈根部的培養基栽到基質(泥炭蛭石珍珠巖=2 : I : I)中。甜葉菊同源四倍體植株煉苗移栽成活率達82%。在此實例中處理不定芽120個，不定芽死亡率為15%，多倍體誘導率為20. 00%，共獲得甜葉菊同源四倍體植株15株組培苗。實施例3(I)不定芽的獲得選取甜葉菊植株的健壯嫩芽，先用洗衣粉洗凈再用流動的清水沖洗I 2h。用75%酒精浸泡30S，無菌水沖洗2 3次之后放入O. 10%的升汞溶液中浸泡5min，用無菌水沖洗3 4次。將滅菌后的莖段接種到下列誘導培養基MS培養基+0. 3mg/L6-BA+0. 2mg/L KT+0. 05mg/LNAA+6500mg/L 瓊脂 +30000mg/L 蔗糖，PH 5. 8 誘導不定芽。培養室以日光燈為光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度(24±1)°C的環境條件下培養20天，誘導出大量不定芽。(2)甜葉菊同源四倍體誘導將不定芽浸泡在濃度為2. Og/L秋水仙素溶液(加入2%二甲基亞砜)中，處理12 48h，每個處理浸泡30個不定芽。浸泡后的不定芽用無菌水沖洗3 4，濾紙吸干水接種到MS基本培養基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度(24±1) °C的環境條件下培養30天，得到變異幼苗。將長至3 4cm的幼苗接種到培養基 1/2MS 培養基 +0. 10mg/LNAA+0. 10mg/LIBA+6500mg/L 瓊脂 +30000mg/L 蔗糖，ΡΗ5· 8 中進行生根培養，生根培養培養室以日光燈為光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度23 25°C的環境條件下培養20天，待根長至2 3cm。(3)根尖染色體計數切取約Icm的根尖用水洗凈，按照以下步驟進行染色體鑒定。預處理用對二氯苯飽和水溶液15°C處理6h ;固定卡諾氏固定液(無水乙醇冰醋酸=3 1)4°C 固定 18h ;前低滲:0. 075mol/L KCL 浸泡 30min ;解離lmol/L HCL60°C水浴中解離Ilmin ;后低滲蒸餾水浸泡30min ;染色制片切取Imm根尖置于載玻片中央加卡寶品紅I滴染色，IOmin后蓋上蓋玻片，壓片鏡檢并拍照。統計甜葉菊染色體條數，染色體數目 2n = 2X2x = 2X22 = 44為四倍體植株。(4)流式細胞術鑒定法采集經根尖染色體技術確定為四倍體植株葉片3-4片葉片，用濾紙吸干水，置于干凈的玻璃培養皿中。加入0. 5mL預冷的組織解離液用鋒利的刀片迅速將葉片切碎，200目尼龍網過濾，1000r/min離心5min，漂洗3次。加入DAPI染液2. OmL, 室溫下靜置反應3min。用移液器吸出組織解離混合液，通過PARTEC流式細胞儀專用的過濾漏斗濾至上樣管中。圖形中的橫坐標表示NDA含量多少；縱坐標表示細胞數量。以二倍體植株為對照，調整GAIN值使峰值位于100處后，檢測其他變異植株，峰值位于200處即為四倍體。(5)擴繁移栽將確定為四倍體的植株切成莖段接種到I步驟中的誘導不定芽培養基內。待不定芽長至2 3cm左右，將其轉入生根培養基中生根培養，苗高3 4cm，根長約2 3cm時即可進行煉苗移栽。煉苗時打開瓶蓋先在培養室煉苗3d，使嫩苗逐漸與外界接觸，提高適應能力。然后在溫室中煉苗3d后洗凈根部的培養基栽到基質(泥炭蛭石 珍珠巖=2 I I)中，甜葉菊同源四倍體植株煉苗移栽成活率達80%。 在此實例中處理不定芽120個，不定芽死亡率為30%，多倍體的誘導率為 32. 14%，共獲得甜葉菊同源四倍體植株26株組培苗。
權利要求
1.甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，其特征在于該方法利用濃度為0.5g/L 2. Og/ L的秋水仙素溶液浸泡甜葉菊不定芽12 48h，用無菌水清洗后接種在MS培養基中，培養 20 30天獲得變異幼苗，再將幼苗接種到生根培養基中，待根長至2 3cm。
2.根據權利要求I所述的甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，其特征在于該方法具體包括以下步驟將不定芽浸泡在含2%二甲基亞砜的濃度為0. 5g/L 2. Og/L秋水仙素溶液中，處理12 48h，浸泡后的不定芽用無菌水沖洗3 4次，吸干水接種到MS培養基中， 在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度23 25°C的環境條件下培養20 30天，得到長3 4cm變異幼苗，將幼苗接種到生根培養基中進行生根培養，待根長至2 3cm。
3.根據權利要求I或2所述的甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，其特征在于該方法所述的生根培養基的組成為1/2MS培養基 萘乙酸0.05 0.10mg/L吲哚乙酸0.05 0.10mg/L瓊脂6500mg/L 。蔗糖30000mg/LPH5.5-5.8
4.根據權利要求I或2所述的甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，其特征在于不定芽的獲得包括以下步驟取甜葉菊植株的嫩芽，滅菌后接種到誘導培養基中，培養溫度23 25°C，每日光照12h，光照度1500 2000Lx，培養15 20天，誘導出不定芽。
5.根據權利要求4所述的甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，其特征在于所述的滅菌方法是將甜葉菊植株的嫩芽先用洗衣粉洗凈，再用流動的清水沖洗I 2h，用75%酒精浸泡30S，無菌水沖洗2 3次之后放入0. 10%的升汞溶液中浸泡5 8min，用無菌水沖洗 3 4次。
6.根據權利要求4所述的甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，其特征在于所述的誘導培養基的組成為MS培養基6-芐基腺嘌呤0.20 0.30mg/L激動素0.10 0.20mg/L萘乙酸0.01 0.05mg/L瓊脂6500mg/L 。蔗糖30000mg/LPH5.5-5.8
7.根據權利要求I所述的甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，其特征在于該方法具體包括以下步驟A、不定芽的獲得取甜葉菊植株的嫩芽，先用洗衣粉洗凈再用流動的清水沖洗I 2h， 用75%酒精浸泡30S，無菌水沖洗2 3次之后放入0. 10%的升汞溶液中浸泡5 8min，用無菌水沖洗3 4次。將滅菌后的嫩芽接種到誘導培養基中，誘導培養基組分為 MS培養基6-芐基腺嘌呤0.20 0.30mg/L激動素0.10 0.20mg/L萘乙酸0.01 0.05mg/L 瓊脂6500mg/L 蔗糖30000mg/L PH5.5-5.8 以日光燈為光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度23 25°C的環境條件下培養15 20天，誘導不定芽； B、甜葉菊同源四倍體誘導將不定芽浸泡在加入2%二甲基亞砜的濃度為O. 5 2. Og/L秋水仙素溶液中，處理12 48h,浸泡后的不定芽用無菌水沖洗3 4次,吸干水接種到MS培養基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度23 25 °C的環境條件下培養20 30天，得到長3 4cm變異幼苗，將幼苗接種到生根培養基中進行生根培養，生根培養基組分為 1/2MS培養基萘乙酸0.05 0.10mg/L吲哚乙酸0.05 0.10mg/L 瓊脂6500mg/L 蔗糖30000mg/L PH5.5-5.8 生根培養以日光燈為光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，溫度23 25°C的環境條件下培養20 30天，待根長至2 3cm。
8.根據權利要求I所述的甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，其特征在于將確定為四倍體的植株擴繁移栽，具體包括以下步驟將確定為四倍體的植株切成莖段接種到權利要求6所述的誘導培養基內，待不定芽長至2 3cm，將其轉入權利要求3所述的生根培養基中生根培養，苗高3 4cm，根長約2 3cm時進行煉苗移栽。
9.根據權利要求8所述的甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，其特征在于所述的煉苗為先在培養室煉苗2 3d，再在溫室中煉苗2 3d后洗凈根部的培養基，栽到由泥炭蛭石珍珠巖=2:1:1的基質中。
全文摘要
本發明公開了一種甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，本發明方法在離體條件下以甜葉菊不定芽作為誘變材料，采用秋水仙素溶液與組織培養技術相結合的方法，進行四倍體誘導培養，通過該方法獲得較高的誘導率并在短期內得到大量的四倍體組培苗，獲得的甜葉菊同源四倍體組培苗節間較二倍體短，葉色深，葉片大而厚，已初步體現了多倍體在形態學上得優勢。
文檔編號A01H4/00GK102613085SQ20121010103
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月9日 優先權日2012年4月9日
發明者向增旭, 李紅 申請人:南京農業大學