專利名稱：一種抗灰霉病的生物殺菌劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種農用生物殺菌劑及其加工方法，確切地說是一種抗灰霉病的生物殺菌劑及其制備方法。
背景技術：
由灰葡萄孢(Botrytis cinerea PersexFr)所致的灰霉病(Botrytis cinerea Pers)，不但是我國草莓危害較嚴重的病害之一，而且殃及其他園藝作物，也是世界性的重要的園藝作物病害。目前又出現單抗、雙抗甚至多抗的灰霉病菌菌株，防止該類病害的任務艱巨。化學防治草莓病除帶來環境污染和病原菌產生抗生以外，重要的是草莓作為一種鮮果品，因對農藥的殘留問題特別敏感，給人的健康帶來心理影響。當前無公害農產品的生產和消費熱潮正在興起，隨著化學物質在農業生產中應用的限制越來越多，對于農業生產中減少植物病蟲害病發揮重要增產作用的農藥，無疑提出了更高要求，各國研究者正在尋求天然生物源農藥，通過篩選和利用抗灰霉菌的有益微生物及其代謝產物的生物防治方法，已成為灰霉病控制的一條重要而有效的途徑。
木霉菌(Trichoderma spp)屬于半知菌類的叢孢菌綱，叢梗孢目叢梗孢科，廣泛存在土壤、根圍、葉圍、種子和球莖等生態環境中。由于木霉菌的廣泛適應性、廣譜性及多機制性，一直是植病生防學家研究的重點對象，目前研究的熱點是通過生物技術方法有目的地改造從自然界分離篩選到的木霉菌，以獲得新型菌株，例如用紫外線照射誘變、原生質體融合和基因轉化技術等研制開發新型木霉菌株。
發明內容
本生物殺菌劑根據木霉良好的生物防治特性，采用木霉為出發菌株，通過發酵培養獲得具有抗灰霉菌活性的生物殺菌劑，所要解決的問題是培養基的篩選和發酵過程的控制。
本生物殺菌劑是將木霉接種在液體培養基(培養液)上進行發酵培養后經分離得到的(即發酵液)。
所述的培養液以麥麩或/和稻糠或/和馬鈴薯為基料(碳源)，幾丁質為誘導物，輔之其他基礎營養成分和水配制而的。麥麩或/和稻糠經干燥粉碎后加適量水煎煮，分離，取其汁液配制培養液，而馬鈴薯是鮮品去皮后粉碎，取鮮粉配制培養液，麥麩、稻糠、馬鈴薯以下簡稱碳源粉。各組份有以下重量百分比碳源粉 1～5％幾丁質 0.5～3.5％FeSO40.01～0.03％KH2PO40.02～0.2％K2HPO40.05～0.25％MgSO40.05～0.35％水 余量。
優選碳源粉 2～4％幾丁質 1～3％FeSO40.015～0.025％KH2PO40.05～0.15％K2HPO40.1～0.2％MgSO40.1～0.3％水 余量。
最佳碳源粉 3％幾丁質 2％FeSO40.02％KH2PO40.1％K2HPO40.15％MgSO40.2％水 余量。
將配制好的培養液調pH5.7～6.5，高壓滅菌后接種，于25～40℃條件下發酵培養5～10天。發酵結束后過濾分離，若發酵終止時pH＞4，則調pH≤4，沉降過濾，濾液調pH5.8～6.2，即是具有抗灰霉病活性的生物殺菌劑。
優選培養液pH6.0～6.2，高壓滅菌后接種，于26～28℃條件下發酵培養6～8天。后處理過程同上。
所述的幾丁質是由蟹、蝦、貝類、昆蟲等甲殼動物的外殼經酸解、洗滌、干燥得到的甲殼質，主要成分是線性高分子多糖和少量的蛋白質。酸解一般使用稀鹽酸，也可以使用工業鹽酸。
本發酵液經江蘇省疾病預防控制中心進行毒性試驗(試驗編號20020571)，大鼠急性經口LD50＞4640mg/Kg，屬低毒級。
本發酵液作為殺菌劑使用需兌水稀釋50倍以上，50倍稀釋液畝用量20～30Kg，葉面噴施，三天后防效為80％，五天后防效達99％，與此同時對作物生長有顯著的刺激作用。
本發明原料易得、價格低廉、工藝簡單，使用方便，對環境無污染，無發酵物殘留，是名副其實的綠色無公害殺菌劑。但產品熱穩定性較差，不同溫度貯藏半年，10℃以下防效95％以上，15℃以下防效80％以上，25℃以下防效65％以上，宜10℃以下低溫貯藏。
具體實施例方式
1、碳源粉的制備取麥麩或稻糠干燥后粉碎，或者鮮馬鈴薯去皮后粉碎，備用。
2、幾丁質的制備取蟹殼、蝦皮或貝殼剔除殘余(剩)腐肉，洗凈后烘干、粉碎，投入工業鹽酸中浸泡24小時，并不斷攪拌，水洗至中性，再蒸餾水洗去氯離子，干燥后粉碎，備用。
3、培養液配制與發酵培養取麥麩或稻糠粉25～30g，加入200～350ml，煮沸0.5～1小時，過濾，待濾液冷卻后加入0.2g FeSO4、1g KH2PO4、1.5g K2HPO4、2g MgSO4和20g幾丁質，或者取鮮馬鈴薯粉25～30g、加入200～350ml水中，然后加入0.2g FeSO4、1g KH2PO4、1.5g K2HPO4、2g MgSO4和20g幾丁質，用蒸餾水稀釋定容至1000ml，最后用檸檬酸鈉溶液調pH至6.0～6.2。
將培養液高壓滅菌后接種，加入無雜菌木霉孢子懸浮液1ml，含孢子1×106個/ml。于26～28℃條件下發酵1周左右，測定終點pH，當pH≤5.3時過濾分離，并用草酸調pH≤4，沉降過濾分離，用三聚磷酸鈉溶液調pH5.8～6.2，即是生物殺菌劑。10℃以下低溫貯藏。
權利要求
1.一種抗灰霉病的生物殺菌劑，其特征在于由木霉接種在含麥麩或/和稻糠汁液或/和馬鈴薯以及幾丁質的液體培養基上經發酵培養、分離得到的pH5.8～6.2的發酵液即是生物殺菌劑。
2.一種抗灰霉病的生物殺菌劑的制備方法，包括液體培養基的配制、滅菌、接種、發酵培養和分離，其特征在于木霉接種在pH5.7～6.5的液體培養基上于25～40℃條件下發酵5～10天；所述的液體培養基含碳源粉1～5％、幾丁質0.5～3.5％、FeSO40.01～0.03％、KH2PO40.02～0.2％、K2HPO40.05～0.25％、MgSO40.05～0.35％、水余量；分離后的發酵液調pH5.8～6.2。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于木霉接種在pH6.0～6.2的液體培養基上于26～28℃條件下發酵6～8天；所述的液體培養基含碳源粉2～4％、幾丁質1～3％、FeSO40.015～0.025％、KH2PO40.05～0.15％、K2HPO40.1～0.2％、MgSO40.1～0.3％、水余量。
4.根據權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于液體培養基含碳源粉汁液3％、幾丁質2％、FeSO40.02％、KH2PO40.1％、K2HPO40.15％、MgSO40.2％、水余量。
全文摘要
一種抗灰霉病的生物殺菌劑，由木霉菌直接發酵制備得到的生物殺菌劑。發酵是在含麥麩或稻糠或馬鈴薯為基料、幾丁質為誘導物和其他基礎營養成分的液體培養基中于25～40℃條件發酵5～10天。本生物殺菌劑經口LD
文檔編號A01N63/02GK1685834SQ200510039128
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月25日 優先權日2005年4月25日
發明者蔣立科, 岳永德, 羅曼, 花日茂, 湯鋒, 操海群 申請人:安徽農業大學