專利名稱：從麻瘋樹種子中提取殺蟲活性成分及麻瘋樹萜醇Ⅰ的方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物性殺蟲活性成分的制備和應用技術領域，具體涉及一種從麻瘋樹種子中提取其含有的殺蟲活性成分及其單體化合物-麻瘋樹萜醇I的方法和它們作為農藥的應用。
背景技術：
鑒于化學農藥本身固有的缺點和人們長期不合理的濫用，不僅導致了農作物嚴重的3R——殘留、抗性和害蟲再猖獗的問題，也破壞了自然界的生態平衡。為了減少化學農藥給人們生活和自然環境帶來的影響，人們開始注重研究開發植物源農藥。由于植物源農藥來源于天然的生物中，具有易降解，殘效期短，害蟲不易產生抗藥性等特點，因而具有廣闊的市場前途。
據報道，我國現有含有殺蟲活性物質的植物近千種，具有控制害蟲性能的植物達400多種。如苦楝、川楝、萬壽菊、豬毛蒿、苦皮藤、苦豆子、非洲山毛豆、黃杜鵑、羊角扭、砂地柏、瑞香狼毒等，目前已從中研制出一批具有廣闊市場潛力的植物殺蟲劑。
麻瘋樹(Jatropha curcas)為大戟科，麻瘋樹屬植物，廣泛分布在熱帶、亞熱帶地區。在我國，云南、廣東、廣西、貴州、福建以及四川等多個省份都具有豐富的資源。麻瘋樹是一種傳統的藥用植物，其樹葉可治療風濕、性病、心絞痛；樹枝乳汁則對疣、皮膚創傷等有很好的療效；樹枝提取物具有抗HIV病毒的效應；根可用于散淤消腫、止血種子可作為瀉藥。另外，從麻瘋樹種子提取的毒蛋白curcin是一種核糖體失活蛋白，對腫瘤細胞有較強的抑制作用。麻瘋樹種子還是一種具有重要經濟價值的油料作物，其含油量高達40％，其種子油經過加工可替代柴油等化石能源，是一種優良的可再生生物能源。
麻瘋樹種子還可用于植物的病蟲害防治。魏琴等(麻瘋樹毒蛋白的抗真菌活性研究，中國油料作物學報，2004，(3))報道了麻瘋樹種子毒蛋白對多種植物真菌具有抑制效果；Cacayorin(Beneficial arthropods regulating population of insect pests on cotton.[J].Cotton Res(Philippines).1993，61-8.)和Solsoloy(Occurrence，mortality factors andwithin plant distribution of bollworm，Helicoverpa armigera(Hubn)on cotton[J].PhilippineJ Sci.1995，1239-20.)報道了用麻瘋樹種子油和種子水提取物在田間防治棉蚜和棉蛉蟲，取得了較好的防治效果；Meshram(Antifeedant activity of Azadirachta indica andJatropha curcas against Papilio demoleus L.[J].Environ Bio，1996，17(4)295-298.)則發現0.3％的麻瘋樹種子油石油醚提取物對Papilio demoleus具有較強的拒食作用；1997年Wink等(Phorbol esters of Jatropha curcas L.biological activities and potentialapplications，inG.M.Gubitz，M.Mittelbach and M.Trabi(Eds.)，Biofuel and IndustrialProducts from Jatropha curcas，GrazDbv-Verlag Univ.)的研究顯示，麻瘋樹種子油對煙草天蛾(Manduca Sexta)，棉蛉蟲(Helicoverpa armigera)，棉蚜(Aphis gossypii)，棉葉蟬(Empoasca biguttula)，玉米象(Sitophilus zeamais)，美洲大蠊(PeriplanetaAmericana)等多種昆蟲都具有較強的毒性。
另據報道，麻瘋樹種子中還含有多種生物活性物質，如Adolf從種子油中分離出12-脫氧-16-羥基佛波醇(12-deoxy-16-hydroxyphorbol)(Irritant phorbolderivatives from four Jatropha curcas.Phytochemistry，1984，23(1)129-132.)；Hirota認為麻瘋樹種子油中至少存在4種該佛波醇的二萜酯，它們可能具有相同的二萜醇部分，其微弱差別僅存在于酸部分，并純化出其中一種稱為DHPB的佛波醇二萜酯(12-deoxy-16-hydroxyphorbol-4’-[12’14’-butadienyl]-6’-[16’18’20’-nonatrienyl]-bicyclo[3.1.0]hecane-(13-O)-2’[carnpxuate]-(16-O)-3’-[8’-butenoic-10’]ate)(A new tumorpromoter from the seed oil of Jatropha curcas L.，an intramolecular diesterof 12-deoxy-16-hydroxyphorbol.Cancer Research，1988，48(20)5800-5804.)；Hass則認為麻瘋樹種子油中存在六種結構非常近似的佛波酯(Novel12-deoxy-16-hydroxyphorbol diesters isolated from the seed oi l of Jatrophacurcas.J.Nat Prod.2002，65(10)1434-1440.)。對于分離出來的佛波酯，許多報道認為是種子中的主要毒性成分之一，能導致脊椎動物的狗、羊、魚及無脊椎動物如軟體動物的釘螺等產生急性毒性。
從以上文獻報道來看，從麻瘋樹種子油和種子所獲得的提取物是用水和石油醚提取的，其中含有什么殺蟲活性成分及其提取方法都未披露；而從麻瘋樹種子油分離出來的幾種生物活性物質也未揭示其對農作物害蟲具有殺蟲功能。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種從麻瘋樹種子中提取殺蟲活性成分的方法。
本發明的目的之二是提供另一種從麻瘋樹種子中提取殺蟲活性成分的方法。
本發明的目的之三是提供一種從麻瘋樹種子中提取麻瘋樹萜醇I的方法。
本發明的目的之四是提供從麻瘋樹種子中提取的含有殺蟲活性成分的乙醇提取物作為農藥的應用。
本發明的目的之五是提供從麻瘋樹種子提取的單體化合物-麻瘋樹萜醇I作為農藥的應用。
為達到本發明目的之一提供的從麻瘋樹種子中提取殺蟲活性成分的方法，其特征在于該方法是將成熟的麻瘋樹種子自然干燥去殼后，將其中的種仁粉碎，用5～10倍質量的無水乙醇，于室溫下浸提24～72h，重復浸提2～3次，合并提取液，并經減壓蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。
為達到本發明目的之二提供的從麻瘋樹種子中提取殺蟲活性成分的方法，其特征在于該方法是將成熟的麻瘋樹種子自然干燥，用榨油機直接榨取種子油，在種子油中加入4～8倍體積的無水乙醇充分攪拌后，于-15～-25℃靜置24～48h，取上層清液減壓蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。榨油的麻瘋樹種子可去殼，也可不去殼。
以上方法獲得的乙醇提取物應低溫、避光儲存，以保證其中成分的活性。
為達到本發明目的之三提供的從麻瘋樹種子中提取麻瘋樹萜醇I的方法，其特征在于該方法是將以上方法所得到的含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物依次進行大柱粗分、中柱細分、制備性薄層層析即得麻瘋樹萜醇I。
其中在對含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物進行大柱粗分時，應先將半油狀濃縮乙醇提取物與200目的硅膠，按質量比1∶1的比例混勻，置于硅膠柱頂端，然后用體積比1～4∶4的乙醚-正己烷進行梯度洗脫，并參照薄層層析分4段收集洗脫液，分別得段I、段II、段III、段IV洗脫液，最后用乙醇將未洗脫的成分洗下為段V洗脫液；硅膠柱采用常規濕法裝柱，固定相為200目的硅膠H，柱徑30cm，高度8cm。
其中在對大柱粗分所獲得的段V洗脫液進行中柱細分時，應先將其濃縮，然后與300目的硅膠，按質量比1∶1的比例混勻，置于硅膠柱頂端，用體積比50～9∶1的乙醚-甲醇進行梯度洗脫，終了溶劑是甲醇，并參照薄層層析分部收集洗脫液，分別得到流分1、流分2、流分3和流分4；硅膠柱采用常規濕法裝柱，固定相為300目的硅膠H，柱徑3cm，高度80cm。
其中制備性薄層層析過程為先鋪制厚度1mm，長寬20×20cm的硅膠GF254薄板，然后取中柱細分得到的流分2，用體積比30∶1乙醚-甲醇展層劑溶解后，用點樣毛細管在薄板上點成直線展層后，取在紫外燈下標記Rf值約為0.58的譜帶刮板，最后將刮板下來的物質再用體積比30∶1乙醚-甲醇溶解、過濾、濃縮得麻瘋樹萜醇I樣品。
該麻瘋樹萜醇I顯示出如下物化特性外觀為白色油狀物；易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑；以硫酸-香莢醛為顯色劑，在硅膠GF254薄層上呈現紫紅色斑點；MeOH KBr波譜檢測的主要數據為UVλnm237，283；IR max cm-13420(顯示有羥基結構，-OH)，2950，2927，2855(為CH2振動區)，1696(顯示有C＝O)，1461(顯示有苯環，C6H12)，1381(CH)；1HNMRδppm0.840(3H，d，J＝7Hz，H3-18)，2.168(12H，4acetates)，2.500(2H，AB，H2-5)，4.225(2H，AB，H2-16)，4.472(2H，S，H2-20)，4.915(1H，S，OH-9)，5.328(1H，m，H-3)；13C NMR17；將其通過高效液相色譜儀(HPLC)檢測，僅呈現一個單一的色譜峰，見附圖，其保留時間在9.99-10.64min。高效液相色譜(HPLC)的檢測條件為固定相為Spherisorb C18反相色譜柱，柱長25cm，內徑46mm；以甲醇-水(70∶30)為流動相；檢測波長為283nm；流速為1.0mL/min；柱溫25℃；進樣量20μL。
為達到本發明目的之四還提供了將上述方法從麻瘋樹種子中提取的含有殺蟲活性成分的乙醇提取物作為農藥的應用。
為達到本發明目的之五還提供了將上述方法從麻瘋樹種子提取的單體化合物-麻瘋樹萜醇I作為農藥的應用。
由于麻瘋樹種子中含有較為復雜的化學成分，本發明為了從中最有效地提取具有殺蟲活性的成分，篩選了以石油醚、乙酸乙酯和乙醇為溶劑的種子提取物的殺蟲活性，發現以乙醇為溶劑對種子中的殺蟲活性成分的提取最充分，確定了乙醇提取物是種子中殺蟲活性成分主要集中的部分，其活性最高，見表1。用乙醇提取物作生物活性測試，不僅在室內實驗中對蘿卜蚜和菜青蟲顯示出較強的殺蟲活性(見表2、3)，在田間試驗中也對蘿卜蚜具有較好的防治效果(見表4)，這說明乙醇提取物殺蟲活性強，作用譜廣，作用方式多樣，在一定濃度范圍內，對同翅目和鱗翅目等多種農作物害蟲具有觸殺、胃毒和拒食活性，而且一定濃度的種子乙醇提取物還可與商品印楝乳油的殺蟲活性媲美。而將本發明獲得的含有殺蟲活性成分的乙醇提取物，經過本發明提供的提取殺蟲活性單體化合物-麻瘋樹萜醇I的方法處理，可有效地提取到殺蟲物質麻瘋樹萜醇I的單體，其純度高于90％。在分離過程中本發明以薄層層析(TLC)跟蹤其中活性成分，并通過HPLC的檢測，確保了殺蟲活性成分的準確提取。本發明還跟蹤測定了麻瘋樹萜醇I對蘿卜蚜、菜青蟲的觸殺、胃毒、拒食和生長抑制活性(見表8～11)，不僅為進行麻瘋樹萜醇I的毒理學研究和麻瘋樹源植物農藥的開發和利用提供了技術，而且為進一步利用麻瘋樹創制新型無公害植物農藥奠定了基礎。本發明的提取步驟簡便易行，可操作性強，有利于降低提取成本，檢測方法穩定性和重復性好。
四
該圖為本發明提取的麻瘋樹萜醇I的液相色譜圖。
五具體實施例方式
下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發明作進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員根據上述本發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。
實施例1將成熟的麻瘋樹種子自然干燥去殼后，將其中的種仁經組織粉碎機粉碎，用10倍質量的無水乙醇，于25℃下浸提24h，重復2次，合并提取液，并經旋轉蒸發儀減壓蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。
實施例2將成熟的麻瘋樹種子自然干燥去殼后，將其中的種仁經組織粉碎機粉碎，用5倍質量的無水乙醇，于20℃下浸提48h，重復3次，合并提取液，并經旋轉蒸發儀減壓蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。
實施例3將成熟的麻瘋樹種子自然干燥去殼后，將其中的種仁經組織粉碎機粉碎，用8倍質量的無水乙醇，于15℃下浸提72h，重復3次，合并提取液，經過旋轉蒸發儀減壓蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。
比較例1將成熟的麻瘋樹種子自然干燥去殼后，將其中的種仁經組織粉碎機粉碎，用10倍質量的石油醚，于25℃下浸提24h，重復2次，合并提取液，并經旋轉蒸發儀減壓蒸發回收溶劑，即得石油醚提取物。
比較例2將成熟的麻瘋樹種子自然干燥去殼后，將其中的種仁經組織粉碎機粉碎，用10倍質量的乙酸乙酯，于25℃下浸提24h，重復2次，合并提取液，并經旋轉蒸發儀減壓蒸發回收溶劑，即得乙酸乙酯提取物。
以菜青蟲為靶標昆蟲，采用葉片浸漬法，檢測各麻瘋樹種子提取物的殺蟲活性。檢測方法為將實施例1和比較例1、2所獲樣品以少量溶劑充分溶解后，用蒸餾水分別稀釋至不同的濃度；將甘藍葉片修剪成小片，置于各濃度試液中浸2-3秒，晾干至溶劑揮發后飼喂事先饑餓4h的菜青蟲，對照組僅喂用溶劑處理的葉片。菜青蟲置于培養室內，每日用處理葉片飼喂3次，48h后換喂未處理的新鮮甘藍葉片，繼續飼喂直至72h，并記錄各組試蟲的死亡率，統計校正死亡率，結果見表1。從表1結果可見麻瘋樹種子石油醚和乙醇提取物對菜青蟲都具有殺蟲的活性，但以乙醇提取物的殺蟲效果最好。
表1 以蘿卜蚜和菜青蟲為靶標昆蟲，檢測麻瘋樹種子乙醇提取物的生物活性。對蘿卜蚜的觸殺活性采用張宗炳的直接浸液法(殺蟲劑的毒力測定(原理、方法、應用)，科學出版社，1988，P85)，用不同濃度的乙醇提取物在24小時對蘿卜蚜的觸殺活性見表2。將蘿卜蚜的校正死亡率與乙醇提取物的濃度對數進行直線回歸，統計其毒力回歸方程為Y＝3.5215X+3.5169(R2＝0.9607)，LC50為0.2637％。乙醇提取物對菜青蟲也顯示出較強的胃毒活性，取食不同濃度乙醇提取物處理葉片的菜青蟲的死亡率見表3。其毒力回歸方程為Y＝2.0968X+3.8425(R2＝0.9526)，LC50為0.3765％；乙醇提取物對菜青蟲非選擇性拒食作用的毒力回歸方程為Y＝1.1703X+4.5220(R2＝0.9911)，拒食中濃度AFC50為0.2561％。
表2
表3
實施例4將成熟的麻瘋樹種子自然干燥，不去殼，用榨油機直接榨取得種子油；在種子油中加入8倍體積的無水乙醇充分攪拌后，于零下20℃靜置24h，取上清液于旋轉蒸發儀上蒸發回收溶劑，即得到含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。
實施例5
將成熟的麻瘋樹種子自然干燥，去殼，用榨油機直接榨取得種子油；在種子油中加入4倍體積的無水乙醇充分攪拌后，于零下15℃靜置48h，取上清液于旋轉蒸發儀上蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。
將實施例4、5所獲麻瘋樹種子濃縮乙醇提取物與吐溫-80等體積混合，用超聲波充分乳化，混合均勻后，用清水稀釋至藥液中吐溫-80的含量不超過0.5％的濃度，即配為麻瘋樹種子乙醇提取物農藥。將該農藥用于蘿卜蚜的田間防治試驗，結果見表4。從表中結果顯示，0.5％和0.25％的麻瘋樹種子乙醇提取物對蘿卜蚜具有較好的防治效果，施藥后1天的防治效果最高，可達到87.11％和71.25％，而后略有下降，但至施藥后7天的防治效率仍高于70％；0.25％乙醇提取物就可與0.1％印楝素乳油的防治效果相當。試驗期間未觀察到各處理藥物對蘿卜生長造成不良影響。
表4
注施藥后7天標有相同字母者表示經DMRT法檢驗在5％水平上差異不顯著。
實施例6本實施例為麻瘋樹萜醇I的提取方法。
首先將成熟的麻瘋樹種子自然干燥去殼后，將其中的種仁經組織粉碎機粉碎，用10倍質量的無水乙醇，于25℃下浸提24h，重復2次，合并提取液，并經旋轉蒸發儀減壓蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀乙醇提取物。
將含有殺蟲活性成分的濃縮乙醇提取物進行大柱粗分。即先將半油狀乙醇提取物與200目的硅膠，按質量比1∶1的比例混勻，置于硅膠柱頂端，然后用流動相乙醚-正己烷進行梯度洗脫，各梯度洗脫液按體積比計，依次為乙醚-正己烷1∶1，乙醚-正己烷1∶2，乙醚-正己烷1∶4，并參照薄層層析分4段收集洗脫液，分別得段I、段II、段III、段IV洗脫液，最后用乙醇將未洗脫的成分洗下為段V洗脫液。硅膠柱采用常規濕法裝柱，固定相為硅膠H，柱徑30cm，高度8cm。
參照實施例1中的毒力測定方法檢測各段流分對3齡家蠶的殺蟲活性，結果見表5。可見段V的毒力最強，因此下一步將段V進行進一步中柱細分。
表5 將段V洗脫液進行濃縮后進行中柱細分。即先將濃縮后的段V洗脫液與300目的硅膠，按質量比1∶1的比例混勻，置于硅膠柱頂端，然后用流動相起始溶劑乙醚-甲醇進行梯度洗脫，各梯度洗脫液按體積比計，依次為乙醚-甲醇50∶1，乙醚-甲醇30∶1、乙醚-甲醇9∶1，終了溶劑為甲醇，并參照薄層層析分部收集洗脫液，分別得到流分1、流分2、流分3和流分4。硅膠柱采用常規濕法裝柱，固定相為300目的硅膠H，柱徑3cm，高度80cm。
參照實施例1中的毒力測定方法檢測各流分對3齡家蠶的殺蟲活性，結果見表6，其中僅流分2顯示出明顯的殺蟲活性，因此對流分2進行進一步分離純化。
表6 將流分2進行制備性薄層層析以純化。先鋪制厚度1mm，長寬20×20cm的硅膠GF254薄板，然后取中柱細分得到的流分2，用體積比30∶1乙醚-甲醇展層劑溶解后，用點樣毛細管在薄板上點成直線展層后，在紫外燈下顯色，將Rf值為0.57-0.59的一條譜帶刮板，最后將刮板的收集物再用體積比30∶1乙醚-甲醇溶解、過濾、濃縮得麻瘋樹萜醇I樣品。
參照實施例1中的毒力測定方法檢測麻瘋樹萜醇I樣品對3齡家蠶的殺蟲活性，其結果見表7。從結果LC50為0.4049mg/mL可見麻瘋樹萜醇I對鱗翅目昆蟲家蠶具有很強的胃毒活性。
表7 將麻瘋樹萜醇I進行HPLC檢測條件為固定相為Spherisorb C18反相色譜柱，柱長25cm，內徑46mm；以甲醇-水(70∶30)為流動相；檢測波長為283nm；流速為1.0mL/min；柱溫25℃；進樣量20μL。麻瘋樹萜醇I在HPLC上僅呈現單一的色譜峰，其保留時間為10.14min，見附圖。
實施例7本實施例為麻瘋樹萜醇I的提取方法。
首先將成熟的麻瘋樹種子自然干燥去殼后，將其中的種仁經組織粉碎機粉碎，用5倍質量的無水乙醇，于20℃下浸提72h，重復2次，合并提取液，并經旋轉蒸發儀減壓蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。
將含有殺蟲活性成分的濃縮乙醇提取物進行大柱粗分。即先將半油狀濃縮乙醇提取物與200目的硅膠，按質量比1∶1的比例混勻，置于硅膠柱頂端，然后用流動相乙醚-正己烷進行梯度洗脫，各梯度洗脫液按體積比計，依次為乙醚-正己烷1∶1，乙醚-正己烷1∶2，乙醚-正己烷1∶4，并參照薄層層析分4段收集洗脫液，分別得段I、段II、段III，段IV洗脫液，最后用乙醇將未洗脫的成分洗下為段V洗脫液。硅膠柱采用常規濕法裝柱，固定相為硅膠H，柱徑30cm，高度8cm。
將段V洗脫液進行濃縮后進行中柱細分。即先將濃縮后的段V洗脫液與300目的硅膠，按質量比1∶1的比例混勻，置于硅膠柱頂端，然后用流動相起始溶劑乙醚-甲醇進行梯度洗脫，各梯度洗脫液按體積比計，依次為乙醚-甲醇50∶1，乙醚-甲醇30∶1、乙醚-甲醇9∶1，終了溶劑為甲醇，并參照薄層層析分部收集洗脫液，分別得到流分1、流分2、流分3和流分4。硅膠柱采用常規濕法裝柱，固定相為300目的硅膠H，柱徑3cm，高度80cm。
將流分2進行制備性薄層層析以純化。先鋪制厚度1mm，長寬20×20cm的硅膠GF254薄板，然后取中柱細分得到的流分2，用體積比30∶1乙醚-甲醇展層劑溶解后，用點樣毛細管在薄板上點成直線展層后，在紫外燈下顯色，將Rf值為0.57-0.59的-條譜帶刮板，最后將刮板的收集物再用體積比30∶1乙醚-甲醇溶解、過濾、濃縮得麻瘋樹萜醇I樣品。
以蘿卜蚜和菜青蟲為靶標昆蟲，檢測麻瘋樹萜醇I的生物活性。
用微量點滴法檢測不同濃度的麻瘋樹萜醇I對蘿卜蚜的接觸毒性，24h試蟲的死亡率見表8。結果顯示麻瘋樹萜醇I對蘿卜蚜具有較強的觸殺作用，毒力方程為Y＝2.2722X+2.6079，R2＝0.9817，LD50為0.1129μg/頭。
表8
檢測麻瘋樹萜醇I對菜青蟲的胃毒活性，結果見表9。取食麻瘋樹萜醇I后不同時間的毒力回歸方程顯示，麻瘋樹萜醇I對菜青蟲具有較強的胃毒作用，并隨著處理時間延長，菜青蟲死亡率逐漸增高，LC50則隨著時間而降低，48h，72h和120h LC50分別為1.2753，0.8318，0.3991mg·mL-1。
表9
檢測麻瘋樹萜醇I對菜青蟲的非選擇拒食作用，其結果見表10。檢測結果顯示菜青蟲對麻瘋樹萜醇I處理葉片的取食都顯著低于對照組，并隨處理濃度增大，取食量減少。24h和48h的拒食回歸方程分別為Y＝2.0098X+1.8275(R2＝0.967)，Y＝3.2057X-0.6303(R2＝0.9653)；AFC50分別為0.3789mg/mL和0.5706mg/mL。從AFC50來看，麻瘋樹萜醇菜青蟲的拒食效果在24h時最高，48h有所減弱。
表10
注*表示t測驗，與對照組差異顯著(P＜0.05)；**表示t測驗，與對照組差異極顯著(P＜0.01)。
檢測麻瘋樹萜醇I對菜青蟲的生長抑制作用，其結果見表11。結果顯示麻瘋樹萜醇I對菜青蟲體重增長有一定的抑制作用。即使取食濃度僅0.125mg/ml的處理葉片后，其生長都顯著低于對照組；1.0mg/ml的麻瘋樹萜醇I48h時對菜青蟲的體重增長抑制率達到79.61％。
表11
注*表示t測驗，與對照組差異顯著(P＜0.05)；**表示t測驗，與對照組差異極顯著(P＜001)。
權利要求
1.一種從麻瘋樹種子中提取殺蟲活性成分的方法，其特征在于該方法是將成熟的麻瘋樹種子自然干燥去殼后，將其中的種仁粉碎，用5～10倍質量的無水乙醇，于室溫下浸提24～72h，重復浸提2～3次，合并提取液，并經減壓蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。
2.一種從麻瘋樹種子中提取殺蟲活性成分的方法，其特征在于該方法是將成熟的麻瘋樹種子自然干燥，用榨油機直接榨取種子油，在種子油中加入4～8倍體積的無水乙醇充分攪拌后，于-15～-25℃靜置24～48h，取上層清液減壓蒸發回收溶劑，即得含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物。
3.一種從麻瘋樹種子中提取麻瘋樹萜醇I的方法，其特征在于該方法是將權利要求1或2所得到的含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物依次進行大柱粗分、中柱細分、制備性薄層層析即得麻瘋樹萜醇I。
4.根據權利要求3所述的從麻瘋樹種子中提取麻瘋樹萜醇I的方法，其特征在于在對含有殺蟲活性成分的半油狀濃縮乙醇提取物進行大柱粗分時，應先將半油狀濃縮乙醇提取物與200目的硅膠，按質量比1∶1的比例混勻，置于硅膠柱頂端，然后用體積比1～4∶4的乙醚—正己烷進行梯度洗脫，并參照薄層層析分4段收集洗脫液，分別得段I、段II、段III、段IV洗脫液，最后用乙醇將未洗脫的成分洗下為段V洗脫液；硅膠柱采用常規濕法裝柱，固定相為200目的硅膠H，柱徑30cm，高度8cm。
5.根據權利要求3所述的從麻瘋樹種子中提取麻瘋樹萜醇I的方法，其特征在于在對大柱粗分所獲得的段V洗脫液進行中柱細分時，應先將其濃縮，然后與300目的硅膠，按質量比1∶1的比例混勻，置于硅膠柱頂端，用體積比50～9∶1的乙醚—甲醇進行梯度洗脫，終了溶劑是甲醇，并參照薄層層析分部收集洗脫液，分別得到流分1、流分2、流分3和流分4；硅膠柱采用常規濕法裝柱，固定相為300目的硅膠H，柱徑3cm，高度80cm。
6.根據權利要求3所述的從麻瘋樹種子中提取麻瘋樹萜醇I的方法，其特征在于制備性薄層層析過程為先鋪制厚度1mm，長寬20×20cm的硅膠GF254薄板，然后取中柱細分得到的流分2，用體積比30∶1乙醚—甲醇展層劑溶解后，用點樣毛細管在薄板上點成直線展層后，在紫外燈下顯色，將Rf值為0.57-0.59的一條譜帶刮板，最后將刮板的收集物再用體積比為30∶1乙醚—甲醇溶解、過濾、濃縮得麻瘋樹萜醇I樣品。
7.權利要求1～2中任何一項提取的殺蟲活性成分作為農藥的應用。
8.權利要求3～6中任何一項提取的麻瘋樹萜醇I作為農藥的應用。
全文摘要
本發明公開了一種從麻瘋樹種子中提取殺蟲活性成分及麻瘋樹萜醇I的方法和應用。該殺蟲活性成分是從去殼的種仁或種子油中加入4～10倍的無水乙醇在一定溫度條件下獲取的，生物活性測試結果表明，含有殺蟲活性成分的乙醇提取物不僅在室內實驗中對蘿卜蚜和菜青蟲顯示出較強的殺蟲活性，在田間試驗中也對蘿卜蚜具有很好的防治效果。該麻瘋樹萜醇I是將含有殺蟲活性成分的乙醇提取物經硅膠柱層析、制備性薄層層析收集目的條帶，分離出來的單體化合物，是麻瘋樹種子中具有殺蟲活性的主要成分，在一定濃度范圍內，對農作物害蟲具有觸殺、胃毒、拒食和生長抑制作用。這為進一步利用麻瘋樹創制新型無公害植物農藥奠定了基礎。
文檔編號A01N31/00GK1817130SQ200610020278
公開日2006年8月16日 申請日期2006年2月14日 優先權日2006年2月14日
發明者李靜, 陳放 申請人:四川大學