專利名稱：糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種糜蛋白酶的新用途，具體是糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用。
背景技術：
使用有機殺蟲劑(農藥)是消滅農業和衛生害蟲，保障農作物增產、穩產及人類健康的經濟有效的手段。目前使用的有機殺蟲劑以有機磷和菊酯類為主。長期以來，由于過多過濫地使用殺蟲劑，致使農產品、土壤和水源中的殺蟲劑大量殘留，污染日趨嚴重。尋求有效的方法降解殺蟲劑，減少對環境及人體健康的危害是目前迫切需要解決的問題。
生物處理戰略對根除和減少殺蟲劑殘留具有較大的潛力。例如，可將污染的農產品、水源和土壤通過含酶的生物發生器，降解殺蟲劑，從而減少其殘留水平和時間。
糜蛋白酶屬絲氨酸蛋白酶家族，生理學功能包括攝食蛋白的消化、血液凝固、免疫反應、信號傳導、激素活化和發育，其在昆蟲幼蟲中腸大量表達，參與攝食蛋白的消化。有研究顯示，鱗翅類昆蟲中腸絲氨酸蛋白酶可降解其體內病原體蘇云金桿菌的伴孢晶體蛋白，從而抵抗蘇云金桿菌對昆蟲的殺傷力。申請人在先前的中國專利申請(申請號為02112820.0)的說明書第1頁，提到“糜蛋白酶基因在抗溴氰菊酯淡色庫蚊中高表達，因此推測淡色庫蚊糜蛋白酶基因可能與淡色庫蚊抗溴氰菊酯抗藥性有關。”但是，該申請僅根據糜蛋白酶基因在抗溴氰菊酯淡色庫蚊中高表達的特點，不能充分表明該基因(淡色庫蚊糜蛋白酶)與淡色庫蚊抗溴氰菊酯抗藥性有關，有待進一步的深入研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種糜蛋白酶的新用途。
本發明的技術方案是糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用。
上述技術方案中所說的有機殺蟲劑可以是但不限于有機磷類、菊酯類殺蟲劑。
上述技術方案中所說的有機磷類殺蟲劑可以是但不限于馬拉硫磷、二嗪農殺蟲劑，菊酯類殺蟲劑可以是但不限于溴氰菊酯、高效氯氰菊酯殺蟲劑。
上述技術方案中所說的糜蛋白酶優選但不限于淡色庫蚊糜蛋白酶、牛源性糜蛋白酶。
發明人應用基因重組及蛋白表達技術，將在殺蟲劑抗性蚊蟲中高表達的糜蛋白酶基因片段克隆到pET-32a(+)質粒中，構建pET-32a(+)/NYD-Ch重組質粒，轉化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)并誘導表達；表達產物經鎳金屬螯合親和層析后獲得重組蛋白，復性為活性蛋白；將糜蛋白酶活性蛋白與溴氰菊酯共同對蚊四齡幼蟲進行生物測定，結果蚊敏感和抗性品系的LC50分別提高0.022和2.8ug/ml，表明表達的糜蛋白酶能使溴氰菊酯降解。
用NYD-Ch表達蛋白作用溴氰菊酯后進行氣相色譜分析顯示，隨著NYD-Ch濃度的增加，溴氰菊酯含量逐漸下降，表明糜蛋白酶對溴氰菊酯有直接降解作用；質譜分析進一步顯示，NYD-Ch可將溴氰菊酯分解為對哺乳動物無毒的二溴乙烯二甲基環丙烷羧酸(Br2CA)和苯氧基安息香酸(3-PBA)。在24小時內，10mg NYD-Ch表達蛋白可降解4.03ug溴氰菊酯，降解率達80.6％。
上述的糜蛋白酶對高效氯氰菊酯、馬拉硫磷、二嗪農殺蟲劑也表現出降解作用。牛源性糜蛋白酶與NYD-Ch同屬于絲氨酸蛋白酶超家族成員，氨基酸比對顯示出比較高的同源性。進一步用牛源性糜蛋白酶進行對殺蟲劑降解測定，亦獲得相似結果。
由于糜蛋白酶可直接降解有機殺蟲劑，且通過基因工程可大量生產，其作為降解劑的應用，可以理解，所說的應用可以具體是但不限于以下方式，如將糜蛋白酶添加于現有的蔬果清洗劑或清潔劑中、用糜蛋白酶來治理被有機殺蟲劑污染的土壤和廢水以及用糜蛋白酶對有機殺蟲劑中毒的人、畜進行解毒等。
本發明的有益效果體現在，提供了一種糜蛋白酶的新用途，為大規模應用于清除農產品表面的殘留殺蟲劑、治理被殺蟲劑污染的土壤和廢水、對殺蟲劑中毒后人、畜的解毒提供新的途徑。
圖1為重組原核表達質粒pET-32a(+)/NYD-Ch的構建示意圖。
圖2為NYD-Ch在E.coli BL21(DE3)中表達、純化的SDS-PAGE分析；其中M為蛋白分子量標準；1為空載菌對照；2為未誘導的NYD-Ch重組菌對照；3為誘導表達的NYD-Ch重組菌；4為純化的NYD-Ch重組表達蛋白。
圖3為NYD-Ch重組蛋白的Western Blot鑒定分析；其中M為蛋白分子量標準；1為誘導表達的NYD-Ch重組蛋白；2為空載對照。
圖4為pH對NYD-Ch酶活力的影響。
圖5為NYD-Ch及其降解產物的GC分析；其中A為NYD-Ch；B為溴氰菊酯；C為NYD-Ch與溴氰菊酯作用后的降解產物。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
下面結合具體的實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。
實施例1淡色庫蚊糜蛋白酶(NYD-Ch)對溴氰菊酯的降解作用1)采用基因重組法，構建NYD-Ch原核表達載體并誘導表達根據淡色庫蚊糜蛋白酶基因全長序列(參見GENBANK登記號AF468495)設計引物上游引物L5′-CGGAATTCAACATGGCATCGAAACTGACGGT-3′下游引物R5′-ACTAGCGGCCGCTTA AGCATCCTGACGCAGCTG-3′在上游引物中引入EcoR I酶切位點(GAATTC)，并且在酶切位點的上游引進保護性堿基CG；下游引物中引進Not I酶切位點(GCGGCCGC)，其外側引進保護性堿基ACTA，從而保證內切酶的酶切效率。
采用PCR方法擴增NYD-Ch全長序列(813bp)，構建原核克隆載體pGEM-T/NYD-Ch，構建示意圖如圖1所示，PCR和測序鑒定無誤后通過雙酶切，將目的基因片斷亞克隆至表達載體pET-32a(+)中，構建原核表達載體pET-32a(+)/NYD-Ch并轉化至感受態菌BL21(DE3)中。將轉化的重組菌用1mMIPTG在37℃誘導4小時以表達目的蛋白。表達產物經SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，考馬斯亮藍染色判斷分子量大小。如圖2所示，可知在50kD處有明顯的表達蛋白，和理論上的NYD-Ch蛋白分子量一致。
2)采用金屬螯合親和層析方法純化NYD-Ch表達蛋白并鑒定表達產物經離心收集細菌總蛋白、超聲破碎細胞后，用Ni-NTA純化表達的目的蛋白。用Western blot方法鑒定特異性表達，如圖3所示，可知NC膜上出現50kD的顯色帶，和預設的相當，空載對照組未見顯色條帶出現。
3)采用酶促底物法，用特異性底物測定表達蛋白的活性選用BTEE和S(Ala)2ProPhe-pNA作為糜蛋白酶特異性底物，在不同pH下對NYD-Ch表達蛋白進行鑒定。將酶液與底物在pH為4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0的緩沖液中30℃反應20min，各對應的pH梯度分別以不加酶液的底物為對照，通過測定不同pH條件下的酶活力，確定酶的最適反應PH。如圖4可知，NYD-Ch最大活力通過S(Ala)2ProPhe-pNA獲得，酶的活力隨著pH的增高而增大，在pH為8.00-11.0的范圍內較高，在10.0時達最高。
選用絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、糜蛋白酶抑制劑TPCK通過對活性位點的抑制實驗確定蛋白的特性。結果如表1，可知PMSF、TPCK能明顯的抑制NYD-Ch的活力，證實NYD-Ch具有糜蛋白酶活性。
表1 抑制劑對表達蛋白NYD-Ch和牛糜蛋白酶活力的影響
4)用氣相色譜結合質譜分析的方法，測定NYD-Ch對溴氰菊酯的降解率在六份樣品中，分別各加入0、0.1、0.5、1、5、10mg的NYD-Ch表達蛋白和5ug的溴氰菊酯(純度＞98％，法國羅素優克福公司產品)加水定容至1ml，29℃孵育24h。樣品液中加入1ml的丙酮，旋渦振蕩30s。加2ml環己烷充分混勻、提取，2,000rpm/min離心10min，吸取上層液；用環己烷重復提取2次后，合并所有上層液，在60℃水浴中用氮氣吹干溶劑。用0.2ml環己烷浸潤、溶解殘留物，以0.6ul選樣量上色譜測定溴氰菊酯的含量，發現溴氰菊酯的降解率與酶濃度在0.5-10mg范圍內呈現良好的相關性，實驗結果見圖5及表2。GC/MS分析，表達蛋白NYD-Ch能使溴氰菊酯降解為Br2CA和3-PBA。
表2 不同劑量表達蛋白NYD-Ch對溴氰菊酯的降解率
實施例2 NYD-Ch降解溴氰菊酯后的代謝產物對淡色庫蚊不同品系四齡幼蟲的毒性測定實驗分敏感和抗性組，終體積為300ml。
敏感組測定A組溴氰菊酯對敏感品系淡色庫蚊四齡幼蟲的毒性測定溴氰菊酯(ppm) 0 0.0010.0050.010.05 0.1 0.5四齡幼蟲(條) 50 50 50 50 50 5050作用24小時后，記錄幼蟲死亡數B組
NYD-Ch作用溴氰菊酯后代謝產物對敏感淡色庫蚊四齡幼蟲的毒性測定溴氰菊酯(ppm)0 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5NYD-Ch(mg/ml)1 1 1 1 1 1 1在28℃，作用24小時后，加入四齡幼蟲四齡幼蟲(條) 50 50 50 50 50 5050作用24小時后，記錄幼蟲死亡數C組溴氰菊酯(ppm)0 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5滅活的NYD-Ch(mg/ml) 1 1 1 1 1 1 1在28℃，作用24小時后，加入四齡幼蟲四齡幼蟲(條) 50 50 50 50 50 5050作用24小時后，記錄幼蟲死亡數D組NYD-Ch對抗性品系淡色庫蚊四齡的毒性測定NYD-Ch(mg/ml)010 100 2505001000四齡幼蟲(條) 50 50 50 50 50 50作用24小時后，記錄幼蟲死亡數抗性品系的測定A組溴氰菊酯對抗性品系淡色庫蚊四齡幼蟲的毒性測定溴氰菊酯(ppm) 00.1 0.5 1.0 5.0 10.0 20.0四齡幼蟲(條) 50 5050505050 50作用24小時后，記錄幼蟲死亡數B組NYD-Ch作用溴氰菊酯后代謝產物對抗性淡色庫蚊四齡幼蟲的毒性測定溴氰菊酯(ppm) 0 0.1 0.51.05.010.020.0NYD-Ch(mg/ml) 1010 10 10 10 10 10在28℃，作用24小時后，加入四齡幼蟲四齡幼蟲(條) 505050 50 50 5050作用24小時后，記錄幼蟲死亡數C組溴氰菊酯(ppm) 0 0.1 0.51.05.010.020.0滅活的NYD-Ch(mg/ml) 101010 10 10 10 10在28℃，作用24小時后，加入四齡幼蟲四齡幼蟲(條) 505050 50 50 5050作用24小時后，記錄幼蟲死亡數D組NYD-Ch對抗性品系淡色庫蚊四齡幼蟲的毒性測定NYD-Ch(mg/ml) 0 10100250500 1000四齡幼蟲(條) 505050 50 50 50
(6)當將絕緣子組裝到火花塞中時進行耐電壓測試如圖1所示的火花塞通過使用各個絕緣子制備。本實施方案每個火花塞的主金屬殼體的螺釘部分的直徑設定為12mm。該火花塞與四閥發動機(具有2000cc的排氣量)相連。當在最高速度下放電和發動機速度為6000r.p.m.時電壓控制在35至38kV，絕緣子尖端(位于圖1中的較低區域)的溫度設定為約700℃，并且發動機連續運轉。在經過50小時后，評估絕緣子中是否有問題。未發現問題的絕緣子以環(○)標記，而在不到50小時就發生絕緣損害(火花擊穿)的絕緣子標記為叉(×)。
表1
A組馬拉硫磷0.07ug/mlNYD-Ch(mg/ml)0 0.05 0.10.150.2四齡幼蟲(條) 50 5050 50 50作用24小時后，記錄幼蟲死亡數B組二嗪農0.5ug/mlNYD-Ch(mg/ml)0 0.050.10.150.2四齡幼蟲(條) 50 50 50 50 50作用24小時后，記錄幼蟲死亡數C組高效氯氰菊酯0.04ug/mlNYD-Ch(mg/ml)0 0.050.10.150.2四齡幼蟲(條) 50 50 50 50 50作用24小時后，記錄幼蟲死亡數實驗結果見表5。
表5 不同有機殺蟲劑及其代謝產物對淡色庫蚊四齡幼蟲的毒力測定
權利要求
1.糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用。
2.根據權利要求1所說的糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用，其特征在于其中所說的有機殺蟲劑是菊酯類殺蟲劑
3.根據權利要求2所說的糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用，其特征在于其中所說的菊酯類殺蟲劑是溴氰菊酯殺蟲劑。
4.根據權利要求2所說的糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用，其特征在于其中所說的菊酯類殺蟲劑是高效氯氰菊酯殺蟲劑。
5.根據權利要求1所說的糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用，其特征在于其中所說的有機殺蟲劑是有機磷類殺蟲劑。
6.根據權利要求5所說的糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用，其特征在于其中所說的有機磷類殺蟲劑是馬拉硫磷殺蟲劑。
7.根據權利要求5所說的糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用，其特征在于其中所說的有機磷類殺蟲劑是二嗪農殺蟲劑。
8.根據權利要求1-7所說的糜蛋白酶作為殺蟲劑降解劑的應用，其特征在于其中所說的糜蛋白酶是淡色庫蚊糜蛋白酶或牛源性糜蛋白酶。
全文摘要
本發明涉及一種糜蛋白酶的新用途，具體是糜蛋白酶作為有機殺蟲劑降解劑的應用。由于糜蛋白酶可直接降解有機殺蟲劑，且通過基因工程可大量生產，這就為大規模應用于清除農產品表面的殘留殺蟲劑、治理被殺蟲劑污染的土壤和廢水、對殺蟲劑中毒后人、畜的解毒提供新的途徑。
文檔編號A01N53/08GK1860871SQ20061008524
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月7日 優先權日2006年6月7日
發明者李秀蘭, 孫立新, 孫艷, 錢瑾, 孫靜, 公茂慶, 沈波, 田海生, 馬磊, 朱昌亮 申請人:南京醫科大學