一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法
【專利摘要】本發明闡述一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法。該制備方法包括以下工藝步驟：(1)原料絞碎，抽提蛋白；(2)分級鹽析，糜元粗品；(3)粗品投料，多重結晶；(4)活化；(5)鹽析；(6)透析；(7)凍干。本發明采用羊胰臟為原材料，適應了向穆斯林國家的醫藥界供應藥用原料的渠道；并且已建立起一套規模化的生產工藝，具有簡單、低成本等優點，制備的糜蛋白酶精品效價高達1200單位/毫克以上，符合《中國藥典》(2010版)要求，具有極大的市場競爭力。
【專利說明】一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥領域，設計藥用糜蛋白酶的生化分離技術。具體地說是采用鹽析、多重結晶結合透析等技術來提取糜蛋白酶。
【背景技術】
[0002]糜蛋白酶是從牛胰腺或豬胰腺等哺乳動物胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它在藥理和臨床上的功用主要有兩方面:一、消炎:對各種炎癥、炎性水腫、血腫、潰瘍及血栓等有較好療效。二、抗癌:能促進抗癌藥物向病灶滲透，促使化療藥物發揮作用，局部大劑量使用時作用更強。大劑量使用可治療多種腫瘤，如乳腺癌、宮頸癌、胃癌等，并且無任何毒副作用或不良反應。
[0003]目前中國市場上生產糜蛋白酶的廠家有十幾家，但多采用傳統工藝法生產，制備的糜蛋白酶效價低，而且不穩定。中國專利CN1944641A公開了一種糜蛋白酶的制備方法，采用親和層析工藝從糜蛋白酶原生產高純度糜蛋白酶，但是正如中國專利CN1013025B分析，也存在一些缺點，最主要的，親和層析介質昂貴，可重復使用次數少，介質的使用量大，不適合規模化大生產。而中國專利CN1013025B雖然解決了親和層析的不足，也能獲得高比活的糜蛋白酶，但同樣，比較起傳統工藝來，生產成本太高。在原料的選擇上，中國的廠家亦局限于采用牛胰臟或豬胰臟制備糜蛋白酶。可是隨著糜蛋白酶的應用廣泛，使得國際市場對本產品的需求不斷擴大，質量要求上更加嚴格，要求產品有更高的質量:《中國藥典》(2010版)規定，糜蛋白酶的效價不得少于1000單位/毫克。針對市場需求的擴大和效價提高的要求，本發明采用羊胰臟為原料，對傳統工藝進行了改進和創新。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是為了生產高質量的糜蛋白酶而又降低生產成本，對傳統工藝加以改造，尤其是參數的改造， 提供了一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，該方法包括如下步驟:
[0005]1、糜蛋白酶粗制生產操作:
[0006](I)新鮮的羊胰臟，立即用鑷子和剪刀將脂肪結締組織等除去，置絞碎機中絞碎，稱重。
[0007](2)絞碎物置塑料桶中，按I~3ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸潰20~30小時，在浸潰期中每小時攪拌I次。
[0008](3)將浸潰物置濾袋過濾，濾渣再按I~2ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸潰I~3小時，濾干后棄去濾渣。
[0009](4)將兩次浸潰液合并置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固體硫酸銨242g，使達40%飽和度，靜置12~16小時。
[0010](5)過濾，留取過濾液，固體棄去。
[0011](6)在每1000ml清液中加入固體硫酸銨205g，使達70%飽和度，放置12~16小時。
[0012](7)過濾，留取固體，棄濾液。
[0013](8)將沉淀物按2~4ml/g的比例加水溶解，再按(4) (5) (6) (7)操作法分次加固體硫酸銨近40%和70%飽和度沉淀。
[0014](9)取70%飽和度沉淀物，按I~3ml/g的比例加水溶解，再按0.2~1.5ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.0~5.0。
[0015](10)將溶液靜置20~28°C恒溫箱中40~50小時，即有針狀結晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽濾，即得糜蛋白酶粗品。
[0016]2、糜蛋白酶精制生產操作:
[0017](I)結晶工序
[0018]投料:取糜蛋白酶粗品，置不銹鋼桶內，按5~9ml/g的比例加水溶解，調pH值至
2.5~3.5，攪拌8~10小時后，靜置12~16小時。
[0019]結晶I [0020]靜置結束后攪拌，并調pH值至2.0~3.0。按I~3ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，攪拌10~30分鐘，調pH值至4.0~5.0，置20~28°C條件下，保溫40~48小時，過濾，收集濾餅，濾液棄去。
[0021]結晶II
[0022]按2~4ml/g的比例加入水溶解濾餅,調pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.0~5.0，置20~28°C條件下，保溫20~24小時,過濾,收集濾餅。
[0023]結晶III
[0024]按2~4ml/g的比例加入水溶解濾餅,調pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.0~5.0，置20~28°C條件下，保溫20~24小時,過濾,收集濾餅。
[0025]結晶IV
[0026]按2~4ml/g的比例加入水溶解濾餅,調pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.0~5.0，置20~28°C條件下，保溫20~24小時,過濾,收集濾餅。
[0027](2)活化工序
[0028]稱量濾餅重量，按2~4ml/g的比例加入水溶解，并滴加少量2.5mol/L H2SO4溶液助溶，待完全溶解后，調pH值至7.5~8.5。
[0029]再按0.5~1.5ml/g濾餅的比例加入磷酸鹽緩沖液,攪拌片刻,調節pH值至7.5~
8.5。加入活化劑胰蛋白酶，比例為3~6mg/100ml料液，活化60~80小時。
[0030](3)鹽析工序
[0031]活化結束后調pH值至3.5~4.5，量取活化液體積，按400~600g/L的比例加入固體硫酸銨進行鹽析，放置12~16小時。
[0032]過濾，棄濾液，收集濾餅。
[0033](4)透析工序
[0034]濾餅按I~1.5ml/g的比例加入水，攪拌溶解，用透析紙扎包成袋，將透析袋吊放于透析池中，進行4~6天透析。
[0035](5)凍干工序
[0036]收集、合并透析液，過濾，量取體積，調pH值至6.0~7.0，裝盤、凍干。
[0037]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
[0038]本發明采用鹽析、多重結晶結合透析等技術來提取糜蛋白酶，通過對傳統工藝的改進和創新，不僅生產出了高質量的糜蛋白酶，同時又具有簡單、低成本等優點。
[0039]本發明采用羊胰臟為原料，適應了向穆斯林國家的醫藥界供應藥用原料的渠道，擴大了市場銷售。
[0040]本發明已建立起一套規模化的生產工藝，制備的糜蛋白酶精品效價高達1200單位/毫克以上，符合《中國藥典》(2010版)要求，具有極大的市場競爭力。
【具體實施方式】
[0041]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[0042]實施例1
[0043]1、糜蛋白酶粗制生產操作:
[0044](I)稱取新鮮冷凍的羊胰臟4kg，立即用鑷子和剪刀將脂肪結締組織等除去，置絞碎機中絞碎，稱重。
[0045](2)絞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液4L浸潰22小時，在浸潰期中每小時攪拌I次。
[0046](3)將浸潰物置濾袋過濾，濾渣再用0.125mol/L硫酸溶液4L浸潰I小時，濾干后棄去濾渣。
[0047](4)將兩次浸潰液合并,量取體積7.5L,置塑料桶中，加入固體硫酸銨1.82kg,使達40%飽和度，靜置12小時。
[0048](5)過濾，留取過濾液，量取體積7.4L,固體棄去。
[0049](6)在過濾液中加入固體硫酸銨1.52kg，使達70%飽和度，放置12小時。
[0050](7)過濾，留取固體，稱重118g，棄濾液。
[0051](8)將沉淀物用236ml純化水溶解，再按⑷(5) (6) (7)操作法分次加固體硫酸銨近40%和70%飽和度沉淀。
[0052](9)取70 %飽和度沉淀物66g，用66ml純化水溶解，加入飽和硫酸銨溶液13.2ml，并用5mol/L氫氧化鈉溶液調pH4.1。
[0053](10)將溶液靜置20°C恒溫箱中42小時，即有針狀結晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽濾，即得糜蛋白酶粗品，稱重20.Sg。
[0054]2、糜蛋白酶精制生產操作:
[0055](I)結晶工序
[0056]投料:取糜蛋白酶粗品20.8g，置不銹鋼桶內，加104ml純化水溶解，并加適量
2.5mol/L H2SO4溶液調節pH2.6，攪拌8小時后，靜置12小時。
[0057]結晶I
[0058]靜置結束后攪拌，`并加2.5mol/L H2SO4溶液調ρΗ2.0。加入飽和硫酸銨溶液21ml，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調pH4.1，置20°C條件下，保溫40小時，過濾，收集濾餅，稱重38.1g,濾液棄去。
[0059]結晶II
[0060]濾餅加76.2ml純化水溶解，用2.5mol/l硫酸調pH2.0，加飽和硫酸銨溶液19.0ml,用5mol/L NaOH調pH4.1，置20°C條件下，保溫20小時，過濾，收集濾餅，稱重
33.2g。
[0061]結晶III
[0062]濾餅加66.4ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調pH2.0，加飽和硫酸銨溶液16.6ml,用5mol/L NaOH調pH4.1，置20°C條件下，保溫20小時，過濾，收集濾餅，稱重30.9g0
[0063]結晶IV
[0064]濾餅加61.8ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調pH2.0，加飽和硫酸銨溶液15.4ml,用5mol/L NaOH調pH4.1，置20°C條件下，保溫20小時，過濾，收集濾餅，稱重
30.5g0
[0065](2)活化工序
[0066]加61.0ml純化水溶解濾餅，并滴加少量2.5mol/L H2SO4溶液助溶，待完全溶解后，加 5mol/L NaOH 溶液調 ρΗ7.5。
[0067]加入磷酸鹽緩沖液15.2ml，攪拌片刻，調ρΗ7.5。加入活化劑胰蛋白酶2.4mg,活化60小時。
[0068](3)鹽析工序
[0069]用2.5mol/L硫酸調pH3.1，量取活化液體積70.6ml，加入固體硫酸銨28g進行鹽析，放置12小時，過濾，棄濾液，收集濾餅，稱重33g。
[0070](4)透析
[0071]濾餅加入純化水33ml，攪拌溶解，用透析紙扎包成袋，將透析袋吊放于透析池中，進行4天透析。
[0072](5)凍干工序
[0073]收集、合并透析液，過濾，量取體積3lml，調節pH6.0，裝盤I盤、凍干，稱重7.Sg。
[0074](6)根據《中國藥典》(2010版)規定的糜蛋白酶效價檢測法對本品進行檢驗，本品的效價為1428單位/毫克。
[0075]實施例2
[0076]1、糜蛋白酶粗制生產操作:
[0077](I)稱取新鮮冷凍的羊胰臟4kg，立即用鑷子和剪刀將脂肪結締組織等除去，置絞碎機中絞碎，稱重。
[0078](2)絞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液12L浸潰28小時，在浸潰期中每小時攪拌I次。
[0079](3)將浸潰物置濾袋過濾，濾渣再用0.125mol/L硫酸溶液8L浸潰3.0小時，濾干后棄去濾洛。
[0080](4)將兩次浸潰液合并，量取體積15.6L，置塑料桶中，加入固體硫酸銨3.78kg，使達40%飽和度，靜置16小時。
[0081](5)過濾，留取過濾液，量取體積14.7L,固體棄去。[0082](6)在過濾液中加入固體硫酸銨3.0kg，使達70%飽和度，放置16小時。
[0083](7)過濾，留取固體，稱重126g，棄濾液。
[0084](8)將沉淀物用504ml純化水溶解，再按(4) (5) (6) (7)操作法分次加固體硫酸銨近40%和70%飽和度沉淀。
[0085](9)取70%飽和度沉淀物73g，用219ml純化水溶解，加入飽和硫酸銨溶液103.5ml,并用5mol/L氫氧化鈉溶液調ρΗ5.0。
[0086](10)將溶液靜置28°C恒溫箱中48小時，即有針狀結晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽濾，即得糜蛋白酶粗品，稱重20.9g。
[0087]2、糜蛋白酶精制生產操作:
[0088](I)結晶工序
[0089]投料:取糜蛋白酶粗品20.9g，置不銹鋼桶內，加188ml純化水溶解，并加適量
2.5mol/L H2SO4溶液調節ρΗ3.4，攪拌10小時后，靜置16小時。
[0090]結晶I
[0091]靜置結束后攪拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液調pH2.8。加入飽和硫酸銨溶液62.7ml，攪拌30分鐘，用5mol/L NaOH調pH5.0,置28°C條件下，保溫48小時，過濾，收集濾餅，稱重38.3g，濾液棄去。
[0092]結晶II
[0093]濾餅加153ml純化水溶解，用2.5mol/l硫酸調ρΗ3.0，加飽和硫酸銨溶液76.6ml，用5mol/L NaOH調pH5.0，置28°C條件下，保溫24小時，過濾，收集濾餅，稱重33.9g。
[0094]結晶III
[0095]濾餅加135.6ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調pH3.0，加飽和硫酸銨溶液67.8ml,用5mol/L NaOH調pH5.0,置28 V條件下，保溫24小時，過濾，收集濾餅，稱重
31.3g0
[0096]結晶IV
[0097]濾餅加125.2ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調pH3.0，加飽和硫酸銨溶液62.6ml,用5mol/L NaOH調pH5.0，置26 °C條件下，保溫24小時，過濾，收集濾餅，稱重30.9g0
[0098](2)活化工序
[0099]加123.6ml純化水溶解濾餅，并滴加少量2.5mol/L H2SO4溶液助溶，待完全溶解后，加 5mol/L NaOH 溶液調 pH8.4。
[0100]加入磷酸鹽緩沖液46.3ml，攪拌片刻，調pH8.4。加入活化劑胰蛋白酶9.8mg,活化80小時。
[0101](3)鹽析工序
[0102]用2.5mol/L硫酸調pH4.5，量取活化液體積164ml，加入固體硫酸銨98.4g進行鹽析，放置16小時，過濾，棄濾液，收集濾餅，稱重36g。
[0103](4)透析
[0104]濾餅加入純化水54ml，攪拌溶解，用透析紙扎包成袋，將透析袋吊放于透析池中，進行6天透析。
[0105](5)凍干工序[0106]收集、合并透析液,過濾,量取體積51ml,調節pH6.9,裝盤I盤、凍干,稱重8.lg。
[0107](6)根據《中國藥典》(2010版)規定的糜蛋白酶效價檢測法對本品進行檢驗，本品的效價為1361單位/毫克。
[0108]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化 與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。
【權利要求】
1.一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)原料絞碎，抽提蛋白；(2)分級鹽析，得糜元粗品；(3)粗品投料，多重結晶；(4)活化；(5)鹽析；(6)透析；(X)凍干。
2.權利要求1所述制備方法，其特征在于，各步驟具體為: (1)將羊胰臟絞碎，用硫酸溶液浸潰2次；取濾液，加固體硫酸銨，使達40%飽和度，過濾，取濾液；加固體硫酸銨，使達70%飽和度；過濾，取沉淀物；加水溶解，調pH值至4.0~5.0，抽濾，得糜蛋白酶粗品； (2)結晶工序 用水溶解糜蛋白酶粗品，調PH值至2.5~3.5，靜置8~12小時；結晶:將糜蛋白酶粗品溶解液再調PH值至2.0~3.0 ;加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.0~5.0，置25±3°C條件下，保溫20~48小時，過濾，收集濾餅；濾餅加水溶解，重復上述結晶操作3次，得濾餅； (3)活化工序 用水溶解上步中所得濾餅，調pH值至7.5~8.5 ;加磷酸鹽緩沖液，調節pH值至7.5~8.5 ;加入活化劑，活化60~80小時； (4)鹽析工序 活化液調pH值至3.5~4.5，加入固體硫酸銨進行鹽析，過濾，收集濾餅；
(5)透析工序 濾餅加水溶解，放透析袋，透析4~6天。 (6)凍干工序 收集、合并透析液，過濾，調節pH值至6.0~7.0,裝盤、凍干。
3.根據權利要求2所述的一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述胰臟為羊胰臟，適應了向穆斯林國家的醫藥界供應藥用原料的渠道。
4.根據權利要求2所述的一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟⑵中，飽和硫酸銨溶液與粗品溶液的體積比為I~3。
5.根據權利要求2所述的一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟(3)中加入活化劑的比例為3~6mg/100ml料液，活化60~80小時。
6.根據權利要求5所述的一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述活化劑為胰蛋白酶。
7.根據權利要求2所述的一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟(4)中按400~600g/L的比例加入固體硫酸銨進行鹽析。
8.根據權利要求2所述的一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，濾餅加水溶解的比例為I~1.5ml/g。
9.根據權利要求2所述的一種從羊胰臟中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟(6)中凍干前pH調節為6.0~6.5。
10.一種糜蛋白酶，其特征在于，所述糜蛋白酶通過權利要求1-9任意之一的方法制備得到，其效價為1200~1500單位/毫克。
【文檔編號】C12N9/76GK103725665SQ201310625721
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年11月24日 優先權日:2013年11月24日
【發明者】劉乃山, 李靜潔, 劉君, 劉翠珍 申請人:青島康原藥業有限公司