專利名稱：大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy及其重組蛋白的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，具體講是從大竹蟶cDNA文庫中獲得一種糜蛋白酶基因SgChy的全長cDNA序列，對其結構域進行了重組表達，并分析了該重組產物的糜蛋白酶活性。
背景技術：
絲氨酸蛋白酶(serineprotease)家族包括諸多成員，它們參與消化、凝血、免疫反應、信號轉導、激素激活和發育等過程。糜蛋白酶(chymotrypsin)是絲氨酸蛋白酶中的一種，能切斷蛋白質肽鏈中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽鏈，從而有效酶解蛋白質，在蛋白消化中發揮著重要的作用。糜蛋白酶在現存物種中廣泛存在。目前為止，糜蛋白酶的研究主要集中在哺乳動物中，近年來，陸續出現了有關魚類和海洋無脊椎動物中糜蛋白酶的研究·報道，研究者從草魚、鯽魚和凡納濱對蝦、扇貝的消化腺，鯉魚的胰腺，鱈魚和虹鱒的幽門和以及鍉魚內臟團中分離鑒定出糜蛋白酶，其中對于海洋脊椎動物尤其是海洋魚類糜蛋白酶的研究報道較多，而在海洋無脊椎動物中相關研究比較少，未見關于大竹蟶糜蛋白酶的報道。本發明對于大竹蟶糜蛋白酶基因的克隆、編碼蛋白的重組以及重組蛋白的酶活性分析，填補了大竹蟶糜蛋白酶研究領域的空白。糜蛋白酶作為一種能分解變性蛋白質的蛋白水解酶，具有重要的藥用價值。糜蛋白酶能清創消腫和去除壞死組織的作用，在對于各種炎癥、炎性水腫、血腫、潰瘍及血栓等有較好的療效，可用于創傷或手術后傷口愈合、抗炎、防止局部水腫、積血等；同時，還能促進抗癌藥物向病灶滲透，具有一定的抗癌增效作用，可在局部大劑量使用，治療乳腺癌、宮頸癌和胃癌等多種腫瘤，無任何毒副作用或不良反應。目前國內獲得糜蛋白酶多采用從牛胰或豬胰中經多重結晶結合透析法提取，該方法復雜、耗時長、純化能力弱。本發明克隆了新的大竹蟶糜蛋白酶基因，對其編碼的蛋白進行了重組表達，獲得了具有酶活性的重組蛋白，為生產糜蛋白酶提供了新思路，也為開發新的天然海洋藥物奠定了理論基礎。
發明內容
本發明的目的是要填補有關大竹蟶糜蛋白酶研究的空白，克隆大竹蟶糜蛋白酶基因，對其結構域進行體外重組并分析其重組蛋白的活性，為開發天然的海洋藥物奠定基礎。本發明的目的是由以下技術方案實現的克隆得到了一種大竹蟶糜蛋白酶基因，該基因具有SEQ ID No 1中的核苷酸序列，該序列全長1186bp，5’非編碼區262bp，3’非編碼區186bp，有多聚腺苷酸尾巴，開放閱讀框738bp，編碼245個氨基酸；氨基酸序列如SEQID No :2中所示，成熟肽分子量為27. 11^&，等電點為6.08 ;無信號肽，具有I個保守的TrypSPc結構域。該基因編碼蛋白的重組產物具有糜蛋白酶活性。一種克隆大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy并制備其重組蛋白的方法，所述的方法是從構建的大竹蟶cDNA文庫中，利用現代分子生物學技術分析得到糜蛋白酶基因的EST序列，將對應的質粒轉化后測序得到基因cDNA全長，以原核表達的方法構建其重組質粒，誘導表達重組蛋白，重組蛋白經純化和復性后檢測其糜蛋白酶活性。本發明的優點克隆了一種大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的cDNA全長，該基因具有SEQ ID No :1中的堿基序列，體外重組了該基因的編碼蛋白，其具有SEQ ID No :2中的氨基酸序列，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。該基因及其重組蛋白活性的研究，對于研制天然海洋消炎和抗癌藥物具有潛在的應用價值。本發明的實施例結合實驗及說明書核苷酸序列表進一步說明如下SEQ ID No : I為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的核苷酸序列。SEQ ID No 2為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因編碼蛋白的氨基酸序列。
具體實施例方式本發明的大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因具有SEQ ID No 1的堿基序列，其編碼蛋白具有SEQ ID No :2的氨基酸序列，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。本發明的SgChy的基因克隆及其蛋白重組方法如下實施例I :所述的SgChy的基因克隆方法(I)大竹経cDNA文庫的構建利用Trizol(Invitrogen)試劑從大竹経混合組織中提取總 RNA,根據 ZAP-cDNA.⑧ Synthesis kit 及 ZAP-cDNA Gigapack III Gold CloningKit (Stratagene)試劑盒的使用說明書純化RNA,通過合成第一鏈、第二鏈,加接頭，Xho I限制酶消化，獲得兩端具有不同粘性末端的完全單向cDNA。將該片段插入Uni-ZAP XRVector (lambda phage)。經包裝,滴度測定和擴增，利用 Exassist Helper Phage 和 SOLR菌株從Uni-ZAP XR Vector上體外切割pBluescript⑧噬菌粒，大規模提取質粒DNA進行測序。(2)序列分析與目的基因EST序列的獲得獲得的EST數據用Phrap軟件聚類拼接，生成拼接而成的Contigs和未參與拼接的Singletons。將所獲的Contigs與Singletons分別進行BLASTn和BLASTx分析。對由BLASTn和BLASTx得到的結果，根據相似性序列的功能分別將Contigs和Singletons做功能分類,通過序列比對查找所需目的基因的EST序列。(3)根據⑵步獲得的EST序列，轉化⑴步得到的對應質粒轉化到感受態細胞DH5 a (Transgen)中，培養后挑取選擇陽性克隆，以引物Ml3_F (GTAAAACGACGGCCAG)和M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC)對其進行序列測定，獲得目的基因的cDNA全長。SEQ ID No : I為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的核苷酸序列。SEQ ID No 2為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因編碼蛋白的氨基酸序列。實施例2:大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的體外重組表達(I)利用 PCR 技術，以重組引物 ATGAGATCCATTAATGTCAAGTTGC 和CAGAAGCATGACTTCTTCATCAGAG克隆SgChy的編碼區成熟肽，反應條件為94 °C預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72 °C延伸60s，進行35個循環；最后72 °C延伸IOmin0以I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用膠回收試劑盒(TaKaRa)進行PCR產物的回收和純化，克隆入帶有His標簽的pEASY-El表達載體(Transgen),再轉化入Transl-Tlphage resistant感受態細胞(Transgen)中，LB培養基平板培養后,挑取菌落，以 T7 (TAATACGACTCACTATAGGG)和 CAGAAGCATGACTTCTTCATCAGAG 分別作為正向和反向引物篩選，選取陽性克隆進行序列測定。以質粒提取試劑盒(Promega)提取測序正確克隆的質粒，轉化到大腸桿菌BL21 (DE3) -Transetta (Transgen)中，選取陽性克隆在氨節濃度為50mg/ml的LB液體培養基中220rpm振蕩培養，培養條件為37°C。當培養液濃度達到0D600為O. 5-0. 7時，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，繼續培養4h。取Iml菌液離心，棄去上清后，加入100 μ I蛋白上樣緩沖液，100°C煮沸lOmin，稍離心，棄去上清后，以SDS-PAGE檢測表達產物。剩余菌液離心后，利用His-tag融合蛋白純化試劑盒MagExtractor His-TagNPK-700 (TOYOBO)，按照操作步驟純化蛋白。(2)將(I)步中得到的純化蛋白經含2mM的還原型谷胱甘肽、O. 2mM的氧化型谷胱甘肽、ImM EDTA、50mM Tris_HCl、50mM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸的尿素-TBS甘油緩沖液(pH 8. O)透析復性，尿素濃度從6M逐漸替換到5M、4M、3M、2M、1M，最后一次透析至無尿素的透析液時不加甘油。純化蛋白在每個濃度梯度中4°C透析12h。·實施例3:重組大竹蟶糜蛋白酶rSgChy的酶活性測定實施例2 (2)步得到的復性蛋白以15%的SDS-PAGE檢測后，以BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)測定蛋白濃度，以50mM的Tris緩沖液調節蛋白濃度為O. lmg/ml。以含IOmM CaCl2 的 50mM Tris-HCl 緩沖液溶解 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilide (Sigma)溶于，制成終濃度為 O. ImM 的 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilide 溶液，取290 μ I與10 μ I含有I μ g復性蛋白的溶液在96孔酶標板中混合，室溫作用lOmin。以等量牛糜蛋白酶(Sigma)代替復性蛋白作為陽性對照，每個反應設計3個平行。反應后，測定反應物410nm處的吸光值，以實驗組/陽性對照X100%為重組蛋白的酶活性。實驗測得重組大竹蟶糜蛋白酶rSgChy的酶活性為65. 8%。總結結果本發明克隆得到了大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因，制備了其重組蛋白并驗證了重組蛋白的酶活性。本領域的普通技術人員都會理解，在本發明的保護范圍內，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，都沒有超出本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy，其具有糜蛋白酶活性，來源于大竹蟶CDNA文庫。
2.權利要求I所述大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。
3.權利要求2所述大竹蟶糜蛋白酶基因的編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQID No:2所/Jn ο
4.權利要求2所述的大竹蟶糜蛋白酶基因在制備糜蛋白酶類藥物中的應用。
全文摘要
本發明是大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的分子克隆和體外重組表達技術，本發明利用構建的大竹蟶cDNA文庫，克隆得到了大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的cDNA全長序列，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No1所示；利用原核重組表達技術表達了其編碼蛋白，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。該基因及其重組蛋白的研究為生產糜蛋白酶提供了新思路，也為開發新的天然海洋藥物奠定了理論基礎。
文檔編號A61K38/48GK102787131SQ20121032251
公開日2012年11月21日 申請日期2012年9月3日 優先權日2012年9月3日
發明者劉相全, 楊嘉龍, 楊建敏, 王忠全, 韋秀梅 申請人:山東省海洋水產研究所