卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法

專利名稱：卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法
專利說明卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法 本發明涉及卡瓦胡椒離體組織培養的技術與方法，包括通過芽繁芽、愈傷組織誘導出芽兩條途徑成功實現了卡瓦胡椒無菌、無毒苗植株的再生和快繁。卡瓦胡椒(Piper Methysticum Forst.f)，俗稱卡瓦，多年生胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)灌木類植物，是一種著名的藥用植物，主要分布于瓦努阿圖、斐濟、湯加、巴布亞—新幾內亞及所羅門群島等南平洋諸島國，近年引入我國試種。
卡瓦胡椒在南太平洋諸島國已有3000多年的藥用、栽培歷史。利用卡瓦胡椒根或根莖制備的飲料具有放松肌肉和情緒、恢復體力、促進睡眠、減輕痛苦的作用。藥理成份分析表明，卡瓦胡椒根的主要藥理成份包括卡瓦因、二氫卡瓦因、醉椒苦素、二氫醉椒苦素、羊高寧及去甲氧基高羊寧等α-吡喃酮衍生物，統稱為卡瓦內酯。病理學實驗和臨床實驗證實，卡瓦胡椒根可用于治療精神抑郁癥、神經衰弱、植物性神經紊亂等。
卡瓦胡椒具有只開花不結果的生物學特性，目前主要以扦插方式進行繁殖。扦插繁殖需要消耗大量的健康莖段，影響植株正常生長發育，長期扦插繁殖也導致種苗帶菌、種苗內生菌嚴重，致使種苗退化。發展卡瓦胡椒離體組織培養的技術與方法，將為大規模、商品化生產卡瓦胡椒無菌\無毒種苗、大規模人工栽培卡瓦胡椒打下基礎。
由于長期依靠扦插繁殖，卡瓦胡椒植株表面帶菌、內生菌較為嚴重。如何有效克服內生菌污染問題已經成為發展卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法的關鍵。Taylor and Taufa于1998年進行了嘗試，但沒有成功。2001年Briskin等通過表面消毒、在培養基中添加抗生素等多種辦法，也僅獲得了卡瓦胡椒葉片、莖段的愈傷組織，至今未見有通過離體組織培養技術獲得完整再生卡瓦胡椒植株的報道。
本發明成功克服了卡瓦胡椒離體組織培養中的技術瓶頸——內生菌污染問題，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進行繁殖的單一繁殖方法，通過芽繁芽、愈傷組織誘導出芽兩條途徑成功實現了卡瓦胡椒無菌、無毒苗植株的再生和快繁。本發明克服了卡瓦胡椒離體組織培養中的技術瓶頸——內生菌污染，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進行繁殖的單一繁殖方法，通過芽繁芽、愈傷組織誘導出芽兩條途徑成功實現了卡瓦胡椒無菌、無毒苗植株的再生和快繁。本發明技術方案通過2種組織培養技術路線實現卡瓦胡椒植株再生的技術和方法。其技術路線、步驟及特征如下技術路線、步驟及特征1.采用含有休眠芽莖段→接種于休眠芽誘導培養基上誘導休眠芽發芽→切取生長一定時間和具有一定長度的幼嫩芽接種于誘導培養基→誘導不定芽發生→切取不定芽轉入繼代培養基中增植培養→不定芽轉入生根培養基中誘導不定根發生→形成具有根、莖、葉的完整卡瓦胡椒苗→移植于營養杯→組培苗大田種植的方法。
技術路線、步驟、步驟及特征2.采用含有休眠芽莖段→接種于休眠芽誘導培養基上誘導休眠芽發芽→切取生長一定時間和具有一定長度的幼嫩芽接種于誘導培養基→誘導不定芽發生→切取不定芽葉片誘導愈傷組織發生→將愈傷組織轉入不定芽誘導培養基誘導叢生芽→切取單個芽轉入生根培養基中誘導不定根發生→形成具有根、莖、葉的完整卡瓦胡椒苗→移植于營養杯→組培苗大田種植的方法。
結果分析1、外植體消毒流線型自來水沖洗12小時后，將切割成1cm長的莖段(帶有1個休眠芽)置于70％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動處理10-15分鐘，在培養基上培養10天，可見的污染率僅有41％，這說明這種表面消毒處理對卡瓦胡椒莖段表面泥砂、細菌及其真菌孢子去除均有一定的作用。由于內生菌污染，培養30天時，污染率接近100％。
2、內生菌的去除及無菌芽獲得由于長期扦插繁殖，卡瓦胡椒內生菌污染嚴重，是卡瓦胡椒離體組織培養的技術瓶頸。本研究通過選擇一定生長時間、一定長度的芽尖(來自休眠芽)為次級外植體，成功克服了這一困難，得到了完全無菌的芽。我們的研究表明，選擇生長15天、0.5mm的芽尖用作次級外植體進行芽繁芽，二次污染率可以降低到64％。
3、通過芽繁芽獲得較高的繁殖系數通過芽繁芽途徑，卡瓦胡椒每月增殖系數達7-8。
4、利用無菌苗葉片為外植體獲得胚性愈傷組織并誘導叢生芽以獲得的無菌苗葉片為外植體，通過誘導胚性愈傷組織，繼而誘導叢生芽途徑也獲得了較高的繁殖系數，最高達4.5。
5、高生根率將獲得的無菌芽切割，轉至催根培養基，獲得了最高的生根效率，可達100％。
6、較高的移栽成活率正常條件下生長的小苗在移入大田前進行10-15天左右的馴化培養是必需的。根據本實驗室對不同培養基質的配比試驗，發現在砂∶石灰巖土∶椰糠＝1∶2∶1的基質中生長的小苗成活率高達87.2％。
本研究在國際上首次克服了卡瓦胡椒離體組織培養中的技術瓶頸——內生菌污染，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進行繁殖的單一繁殖方法，通過芽繁芽、愈傷組織誘導叢生芽兩條途徑成功實現了卡瓦胡椒無菌、無毒苗植株的再生和快繁。本方法培養的卡瓦胡椒幼苗為無菌、無毒苗，每月繁殖指數高達7-8，生根率100％，移栽成活率達到87％。通過此項研究，我們已掌握了從取樣到移栽等一整套的操作技術，這項技術打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進行繁殖的單一繁殖方法，可以滿足商品化、工廠化大規模快速生產卡瓦胡椒無菌、無毒栽培苗植株的要求，具有較大的商業應用前景。下面結合實施方式對本發明進行詳細說明1、材料來源以從庫克等南太平洋島國引種、種植于中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室溫室的卡瓦胡椒(Piper MethysticumForst.f)一年生莖作為初始外植體。
2、方法(1)材料預處理及外植體消毒 ①預處理取健康的一年生莖進行經預處理后，用流線型自來水沖洗過夜或不低于12小時；②外植體消毒將初始外植體切割成1cm長的莖段外植體，每個外植體(莖段)帶有1個休眠芽，用70％酒精處理30-60秒，0.1％升汞消毒10-15分鐘，無菌水沖洗3-4次，每次5分鐘。
(2)誘導休眠芽出芽將消毒后的外植體接種于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂培養基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小時光照/12小時黑暗條件下培養，光照強度為1500lx。
(3)切取初生芽及誘導叢生芽切取生長15天、萌發的休眠芽尖端0.5mm芽尖為次級外植體，接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L誘導培養基(PH＝5.8)上誘導出芽。在此基礎上，切取誘導出的芽接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L誘導培養基(PH＝5.8)培養基上，置于26-28℃、12小時光照/12小時黑暗、光照強度為1500lx條件下，以芽為基礎誘導叢生芽。
(4)誘導愈傷組織及叢生芽取芽繁芽途徑獲得的無菌苗葉片，接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養基(pH＝5.8)上誘導愈傷組織，然后將生長良好的愈傷組織快接種于叢生芽誘導培養基MS+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小時光照/12小時黑暗、光照強度為1500lx條件下誘導愈傷組織出芽(叢生芽)。
(5)誘導生根從叢生芽中切取生長良好的單個芽，接種于1/2MS+IBA0.75mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養基(pH＝5.8)上，26-28℃、12小時光照/12小時黑暗、光照強度為1500lx條件下誘導生根。
(6)試管苗苗馴化及移栽將生根苗置于自然光下經2-3天的煉苗后，洗去根上的瓊脂，移栽于滅菌的基質(砂∶火山巖土∶椰糠＝1∶2∶1)中，26-28℃，每日光照培養12小時，強度為800lx，1-15天后移栽入大田。
附相關數據與表格表一休眠芽來源芽的生長時間與污染率之間的關系(使用0.5-1.0mm長芽尖為外植體)
表二激素對芽增殖誘導的影響
表三激素對愈傷組織誘導的影響(愈傷組織鮮重g)
表四4激素對愈傷組織誘導出芽的影響(芽數/每塊愈傷組織)
表五不同濃度IBA對催根效果的影響.


卡瓦胡椒離體組織培養的技術與方法。A.誘導休眠芽出芽；B.誘導芽增殖；C.誘導愈傷組織；D.誘導叢生芽；E.催根；F.組培苗完整植株。
權利要求
1.卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法，即通過2種組織培養技術路線實現卡瓦胡椒植株再生的技術和方法。其技術路線、步驟及特征如下技術路線、步驟及特征1.采用含有休眠芽莖段→接種于休眠芽誘導培養基上誘導休眠芽發芽→切取生長一定時間和具有一定長度的幼嫩芽接種于誘導培養基→誘導不定芽發生→切取不定芽轉入繼代培養基中增殖培養→不定芽轉入生根培養基中誘導不定根發生→形成具有根、莖、葉的完整卡瓦胡椒苗→移植于營養杯→組培苗大田種植的方法。技術路線、步驟、步驟及特征2.采用含有休眠芽莖段→接種于休眠芽誘導培養基上誘導休眠芽發芽→切取生長一定時間和具有一定長度的幼嫩芽接種于誘導培養基→誘導不定芽發生→切取不定芽葉片誘導愈傷組織發生→將愈傷組織轉入不定芽誘導培養基誘導叢生芽→切取單個芽轉入生根培養基中誘導不定根發生→形成具有根、莖、葉的完整卡瓦胡椒苗→移植于營養杯→組培苗大田種植的方法。
2.根據權利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法，其特征在于利用一年生、帶有休眠芽的健康卡瓦胡椒莖為初始外植體。
3.根據權利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法，其特征在于對初始外植體進行預處理，方法為用流線型自來水常溫條件下沖洗12小時。
4.根據權利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法，其特征在于將預處理后的初始外植體即帶有休眠芽的莖，切割成帶有一個休眠芽、約1cm長的莖段作為外植體。然后，將外植體接種于MS+BA 0.5mg/L+IAA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂培養基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小時光照/12小時黑暗條件下培養，光照強度為1500lx。
5.根據權利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法，其特征在于切取生長15天、萌發的休眠芽尖端0.5-1mm芽尖為次級外植體，接種于MS+BA0.5mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L誘導培養基(PH＝5.8)上誘導出芽。在此基礎上，切取誘導出的芽接種于MS+BA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L誘導培養基(PH＝5.8)培養基上，置于26-28C、12小時光照/12小時黑暗、光照強度為1500lx條件下，誘導芽繁芽。
6.根據權利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法，其特征在于取芽繁芽途徑獲得的無菌苗葉片，接種于MS+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養基(pH＝5.8)上誘導愈傷組織，然后將生長良好的愈傷組織快接種于叢生芽誘導培養基MS+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小時光照/12小時黑暗、光照強度為1500lx條件下誘導愈傷組織出芽(叢生芽)。
7.根據權利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法，其特征在于將權利要求5和6獲得的芽，進行催根培養，步驟為將繁殖芽接種于1/2MS+IBA0.75mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養基(pH＝5.8)上，26-28℃、12小時光照/12小時黑暗、光照強度為1500lx條件下誘導生根。
8.根據權利要求1所述，其特征在于所述的卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法，試管苗馴化及移栽步驟為生根苗經2-3天的自然光煉苗后，洗去根上的瓊脂，移栽于滅菌的基質(砂∶火山巖土∶椰糠＝1∶2∶1)中，26-28℃，每日光照培養12小時，強度為800lx，20天后移栽入大田。
全文摘要
卡瓦胡椒離體組織培養技術與方法。本發明涉及通過兩種組織培養技術路線實現卡瓦胡椒植株再生的技術和方法，其主要特征在于克服了卡瓦胡椒無菌離體組織培養中的技術瓶頸——內生菌污染，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進行繁殖的單一繁殖方法，通過芽繁芽、愈傷組織誘導叢生芽兩條途徑成功實現了卡瓦胡椒無菌、無毒苗植株的再生和快繁。本方法培養的卡瓦胡椒幼苗為無菌、無毒苗，每月繁殖指數達7－8，生根率達100％，移栽成活率為87.2％。這項技術的發明和成功應用具有十分重要的社會和經濟效益，能夠為商品化、工廠化大規模快速生產卡瓦胡椒無菌、無毒栽培苗提供技術支撐。
文檔編號A01G1/00GK101040601SQ200610146949
公開日2007年9月26日 申請日期2006年11月19日 優先權日2006年11月19日
發明者張治禮, 陳雄庭, 鄭學勤 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所, 中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室