專利名稱：馬鈴薯脫毒薯苗無菌循環種質保存法的制作方法
技術領域：
本發明涉及馬鈴薯種質資源的保存方法，特別是一種馬鈴薯脫毒薯苗無菌 循環種質保存法。
技術背景馬鈴薯是中國乃至世界上第四大作物，其安全生產關系到社會的穩定，而 種質資源是農業生產的基礎。馬鈴薯是無性繁殖作物，其種植過程中易感染病 毒并在來年的種植中傳遞下去，導致種性退化。莖尖組織培養能有效地脫毒， 防止種性退化，所以保存脫毒馬鈴薯營養體就是對馬鈴薯種質資源的保存。在 試管苗的長期保存中，隨著繼代次數的增加和延長，試管苗出現徒長、徑細弱、 節間長、葉片小等問題。目前為克服上述問題，探討馬鈴薯種質資源的保存方式主要有(l)在液氮中超低溫保存。發表于《甘肅農業科技》2006年第10期的 "馬鈴薯莖尖超低溫保存研究" 一文報道組織培養的莖段經處理后，放入液氮 中保存，再恢復培養，成活率可達42.8%。 (2)用化學試劑處理組培苗，延緩其 生長以達保存的目的。發表于《農村科技》2006年第7期的"馬鈴薯試管苗保 存技術" 一文報道了培養基中加生長延緩劑B9，可延緩組培苗生長，保存期達 145天，延長了繼代培養的間隔時間。發表于《湖南農業大學學報自然科學版》 2005年第5期的"植物生長調節劑對馬鈴薯試管苗生長和保存的影響" 一文報 道，培養基中加4.80mg/L的多效唑PP333,試管苗保存的時間最長可達300天。 另，發表于《山西農業大學學報自然科學版》2003年第2期的"縮節胺在馬鈴 薯脫毒試管苗保存中的作用" 一文也報道了縮節胺對馬鈴薯試管苗有一定的保 存作用。以上兩種保存方式的不足之處是第一種保存法需液氮貯存裝置，不 便推廣應用。而第二種保存法一直需要光照，且繼代時間短要不斷轉接。馬鈴薯莖尖脫毒組織培養技術和脫毒試管微型薯的誘導方法已為公知的成 熟技術。試管微型薯成熟后，本身固有一定時期的休眠特性。發明內容本發明的目的是提出一種馬鈴薯脫毒薯苗無菌循環種質保存法，它在現有 成熟的馬鈴薯莖尖脫毒組織培養技術和脫毒試管微型薯誘導方法的基礎上，采 用試管微型薯和試管苗在無菌環境下循環保存，以達到用簡易設備，較之一般 組織培養不需添加額外試劑的前提下，省時、省工地保存馬鈴薯種質資源，促
進馬鈴薯種植業健康、持續發展。 本發明是這樣實現的一種馬鈴薯脫毒薯苗無菌循環種質保存法，用現有的莖尖組織培養技術獲 得脫毒苗，經誘導得到試管微型薯，其特征在于該試管微型薯轉入培養瓶中于3 5。C的低溫保存200 360天后取出，在溫度為20-25°C、光照為2000~4000 勒克斯的條件下培養40~60天得到無菌苗，無菌苗在溫度為18 2(TC條件下培養 60-80天后得微型薯，重復上述操作，形成脫毒薯苗循環種質保存。所述的微型薯轉入培養瓶前，對培養瓶按如下要求進行滅菌剪1. 0~2. 0 cm 厚、大小相當的海綿墊于培養瓶底，蓋上瓶蓋，放于1. lkg/cm2的壓力下滅菌 30~40分鐘。在無菌操作室將微型薯轉入經無菌處理的培養瓶中，每瓶裝5 10 個試管微型薯。裝有微型薯的培養瓶低溫保存取出后，向瓶內注入20~40mL已滅菌的MS液 體培養基后，在上述溫度、光照條件下得到無菌苗。在無菌操作室內，把20-40mL滅好菌的含有8%蔗糖的MS液體培養基注入裝 有試管無菌苗的培養瓶中，然后將培養物放到溫度為18-20°C、黑暗的培養室中 培養60-80天后誘導得微型薯。本發明與現有技術相比具有如下優點1、 不需復雜的設備。整個過程所需設備滅菌鍋、超凈工作臺及冰箱等為一 般組培養室具備。2、 不添加生長調節劑，利于有機食品的生產。此保存方法充分利用馬鈴薯 塊莖本身所固有的休眠特性，在低溫條件下保存，因此不需添加任何額外化學 試劑，符合生態環保的要求。3、 低溫保存后的微型薯成活率高，且整個過程均為無菌操作，不會因培養 物消毒不當造成污染，所以不易造成種質資源喪失。4、 保存周期長、操作簡單、省時、省工。微型薯在3 5"C的冰箱可保存6~12 個月，培養試管苗需40~60天，誘導結薯要60 80天，累計保存一個周期長達 480多天，而其間只用采收微型薯一次、加MS液體培養基一次，以及加含8% 蔗糖的MS液體培養基一次，操作簡單、省時、省工。
具體實施方式
實施例11) 、用公知技術對薯苗的轉心烏品種進行莖尖脫毒培養，并得到脫毒試管 微型薯。2) 、剪l.O cm厚、大小相當的10塊海綿墊于10個組織培養瓶底，蓋上瓶
蓋，把培養瓶放于l.lkg/ci^的壓力下滅菌30分鐘。3) 、在無菌操作室將無菌試管微型薯轉入操作步驟2)所得的無菌瓶中，每 個瓶內裝5個試管微型薯。) 、微型薯無菌低溫保存將操作步驟3)所得的裝有微型薯的培養瓶存放 于3'C的冰箱。5) 、由微型薯生成試管苗200天后，把裝有試管微型薯的培養瓶從冰箱取 出，在無菌操作室內向每個瓶內注入20mL己滅好菌的MS液體培養基，然后把 所有裝有試管微型薯的培養瓶放于溫度為20~22°C、光照為20001x的組織室內 培養40天后，獲得無菌苗；統計成苗率可達成98%。6) 、誘導結薯在無菌操作室內，向每個裝有試管苗的培養瓶中注入20mL 滅好菌的含有8%蔗糖的MS液體培養基，然后將培養物放到溫度為18°C、黑暗 的培養室中培養，誘導結薯；第60天收獲試管微型薯，平均每株可結薯3個， 平均薯重為0. 35g。實施例2:1) 、用公知技術對薯苗大西洋品種進行莖尖脫毒培養，并得到脫毒試管微 型薯。2) 、剪2.0 cm厚、大小相當的10塊海綿墊于10個組織培養瓶底，蓋上瓶 蓋，把培養瓶放于1. lkg/cn^的壓力下滅菌40分鐘。3) 、在無菌操作室將無菌試管微型薯轉入操作步驟2)所得的無菌瓶中，每 個瓶內裝10個。4) 、微型薯無菌低溫保存將裝操作步驟3)所得的裝有微型薯的培養瓶存 放于4'C的冰箱。5) 、由微型薯生成試管苗360天后，把所有裝有試管微型薯的培養瓶從冰 箱取出，在無菌操作室內向每個瓶內注入40mL已滅好菌的MS液體培養基。然 后把裝有試管微型薯的培養瓶放于溫度為25°C、光照為40001x的組織室內培養 60天后，獲得無菌苗；成苗率可達成95%。6) 、誘導結薯在無菌操作室內，向每個裝有試管苗的培養瓶中注入40mL 滅好菌的含有8%蔗糖的MS液體培養基，然后將培養物放到溫度為20°C、黑暗 的培養室中培養，誘導結薯；第80天收獲試管微型薯，平均每株可結薯5個， 平均薯重為0. 24g。實施例3:1)、用公知技術對薯苗合作88品種進行莖尖脫毒培養，并得到脫毒試管微 型薯。 2) 、剪1.5 ciii厚、大小相當的10塊海綿墊于10個組織培養瓶底，蓋上瓶 蓋，把培養瓶放于1. lkg/cW的壓力下滅菌30分鐘。3) 、在無菌操作室將無菌試管微型薯轉入操作步驟2)所得的無菌瓶中，每 個瓶內裝8個。4) 、微型薯無菌低溫保存將裝操作步驟3)所得的裝有微型薯的培養瓶存 放于5"C的冰箱。5) 、由微型薯生成試管苗250天后，把裝有試管微型薯的培養瓶從冰箱取 出，在無菌操作室內向每個瓶內注入30mL已滅好菌的MS液體培養基。然后把 所有裝有試管微型薯的培養瓶放于溫度為2(TC、光照為30001x的組織室內培養 50天后，獲得無菌苗。成苗率可達成96%。6) 、誘導結薯上述條件下培養獲得的無菌苗，在無菌操作室內，向每個 裝有試管苗的培養瓶中注入30mL滅好菌的含有8%蔗糖的MS液體培養基，然后 將培養物放到溫度為2(TC、黑暗的培養室中誘導結薯。第70天收獲試管微型薯， 平均每株可結薯6個，平均薯重為0.22g。
權利要求
1、一種馬鈴薯脫毒薯苗無菌循環種質保存法，用常規的莖尖組織培養技術獲得脫毒苗，經誘導得到試管微型薯，其特征在于該試管微型薯轉入培養瓶中于3～5℃的低溫保存200～360天后取出，在溫度為20～25℃、光照為2000～4000勒克斯的條件下培養40～60天得到無菌苗，無菌苗在溫度為18～20℃條件下培養60-80天后得微型薯，重復上述操作，形成脫毒薯苗循環種質保存。
2、 根據權利要求1所述的馬鈴薯脫毒薯苗無菌循環種質保存法，其特征 在于微型薯轉入培養瓶前，對培養瓶按如下要求進行滅菌剪1.0 2.0cm厚、 大小相當的海綿墊于培養瓶底，蓋上瓶蓋，放于1.1kg/ci^的壓力下滅菌30 40 分鐘。
3、 根據權利要求1或2所述的馬鈴薯脫毒薯苗無菌循環種質保存法，其 特征在于將微型薯轉入經處理的培養瓶中，每瓶裝5~10個試管微型薯。
4、 根據權利要求1所述的馬鈴薯脫毒薯苗無菌循環種質保存法，其特征 在于裝有微型薯的培養瓶低溫保存取出后，向瓶內注入20 40rnL已滅菌的 MS液體培養基后得到無菌苗。
5、 根據權利要求1所述的馬鈴薯脫毒薯苗無菌循環種質保存法，其特征 在于在無菌操作室內，把20-40mL滅好菌的含有8M蔗糖的MS液體培養基 注入裝有試管無菌苗的培養瓶中，然后將培養物放到溫度為18-20°C、黑暗的 培養室中培養60-80天后誘導得微型薯。
全文摘要
一種馬鈴薯脫毒薯苗無菌循環種質保存法，用現有的莖尖組織培養技術獲得脫毒苗，經誘導得到試管微型薯，其特征在于該試管微型薯轉入培養瓶中于3～5℃的低溫保存200～360天后取出，在溫度為20～25℃、光照為2000～4000勒克斯的條件下培養40～60天得到無菌苗，無菌苗在溫度為18～20℃條件下培養60-80天后得微型薯，重復上述操作，形成脫毒薯苗循環種質保存；本發明采用試管微型薯和試管苗在無菌環境下循環保存，以達到用簡易設備，較之一般組織培養不需添加額外試劑的前提下，省時、省工地保存馬鈴薯種質資源，促進馬鈴薯種植業健康、持續發展。
文檔編號A01H4/00GK101147468SQ20071006636
公開日2008年3月26日 申請日期2007年11月8日 優先權日2007年11月8日
發明者瓊 王, 蔣從蓮, 郭華春, 龍雯虹 申請人:云南農業大學