一種桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物繁育技術領域，涉及一種桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方 法。
【背景技術】
[0002] 根結線蟲（Meloidogynespp.)是一類世界上分布廣泛的植物專性內寄生線蟲，主 要發生在溫帶和熱帶地區，種類繁多，寄主范圍廣，可侵染3000多種植物，每年可造成巨大 的經濟損失。根結線蟲的侵染可造成植物根系統的傷害，使其對養分和水的吸收明顯減少， 植物長勢變弱、產量降低。選育和推廣抗病品種是最為經濟有效地防御措施。
[0003] 為了準確鑒定種質資源材料的根結線蟲抗性，目前，研宄人員建立了許多抗性鑒 定方法，主要分為室外或溫室盆栽鑒定兩種方法。然而無論哪種方法，均需要根結線蟲經過 一個生長周期后將植物根系從土壤中拔出，清洗干凈后統計根結數量或大小，根據抗感標 準對植物的抗性進行判斷，存在環境條件不穩定，歷時較長，統計復雜等缺點。
【發明內容】
[0004] 為了解決現有技術中存在的技術問題，本發明提供了一種操作簡單、安全方便的 桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法。其技術方案如下：
[0005] -種桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法，包括以下步驟：
[0006] (1)育苗：將桃種子低溫砂藏備用。
[0007] (2)二齡根結線蟲的分離：將感染根結線蟲的番茄根打碎，分別過20、100、200、 500目網篩，收集500目網篩上的蟲卵，通過蔗糖浮選法除雜、濃縮蟲卵，將濃縮的蟲卵倒于 鋪有一層200目網篩和兩層濾紙的培養皿中，3d后收集二齡根結線蟲。
[0008] (3)23%PluronicF-127 的制備：稱 23gPluronicF-127 加入 80ml4°C預冷的無 菌水，適當攪拌，放于4°C冰箱中融化。
[0009] (4)接種：采用6孔細胞培養板，每孔中加入5ml23%PluronicF-127和500條 二齡根結線蟲混勻，在膠將要凝固時將桃幼苗根置于孔中，保鮮膜包裹保濕培養。
[0010] (5)染色：在接種30h后取根尖（約I. 5cm)采用次氯酸鈉-酸性品紅-甘油法染 色，染色后壓片。
[0011] (6)統計鑒定：顯微鏡下統計線蟲數量，根據侵染數量界定植物的抗病性。
[0012] 優選地，所述桃種子低溫砂藏3-4個月后發芽，接種時取出。
[0013] 優選地，在所述步驟（2)中收集的蟲卵可經3000r/min離心3min棄部分上清增加 蟲卵濃度，顯微鏡下計算線蟲濃度，達到每100y1 100條，分離后當天接種。
[0014] 優選地，在所述步驟（3)中PluronicF-127是一種共聚物，其23%水溶液在15°C 以下為液態，以上為固態，根結線蟲可在其中自由移動，且無毒性。
[0015] 優選地，在所述步驟（5)中取根尖后，將植株根系插入23%PluronicF-127中，仍 能存活長出側根，可以用于移栽。
[0016] 優選地，在所述步驟（5)中次氯酸鈉-酸性品紅-甘油法染色過程如下：
[0017] 1)洗凈根，取長約I. 5cm的根尖放于盛有50ml自來水的燒杯中，加入次氯酸鈉至 1. 5%，處理4_6min，適當攪拌。
[0018] 2)根尖用自來水沖洗30-45s，后浸泡在自來水中15min，去除殘留的次氯酸鈉。
[0019] 3)根尖用濾紙吸干表面水分，然后放于盛有30ml水和Iml染色劑（3. 5g酸性品 紅，250ml乙酸，750ml蒸餾水）的燒杯中，煮沸30s。
[0020] 4)冷卻至室溫，多余的染色劑用流水沖掉，后將根尖放于20_30ml的酸化甘油中 (甘油中滴加2-3滴5mol/lHcl)，煮沸后冷卻。
[0021] 5)根尖可壓在載玻片上觀察。
[0022] 與現有技術相比，本發明的有益效果：
[0023] 本發明設計新穎，操作簡單，安全方便，提供了一種能對植物的根結線蟲抗性進行 離體快速篩選的方法，解決了試驗中植物根結線蟲抗性鑒定不穩定，歷時長，統計復雜的問 題。該方法用于植物的根結線蟲抗性鑒定，能在接種兩天內根據根結線蟲侵染數量就能對 植物的根結線蟲抗性作出準確的判斷。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術方案。
[0025] 實施例
[0026] -種桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法，包括以下步驟：
[0027] (1)育苗：將貝蕾（高感）和白根甘肅桃（高抗）種子低溫砂藏備用，砂藏3-4個 月后種子發芽，用于接種時取出。
[0028] (2)二齡根結線蟲的分離：將感染根結線蟲的番茄根打碎，分別過20、100、200、 500目網篩，收集500目網篩上的蟲卵，通過蔗糖浮選法除雜、濃縮蟲卵，將濃縮的蟲卵倒于 鋪有一層200目網篩和兩層濾紙的培養皿中的，3d后收集二齡根結線蟲，3000r/min離心 3min棄部分上清增加蟲卵濃度，顯微鏡下計算線蟲濃度，達到每100y1 100條，分離后當 天接種。
[0029] (3)23%PluronicF-127 的制備：PluronicF-127 是一種共聚物，其 23%水溶液 在15°C以下為液態，以上為固態，根結線蟲可在其中自由移動，且無毒性。稱23gPluronic F-127加入80ml4°C預冷的無菌水，適當攪拌，放于4°C冰箱中融化。
[0030] (4)接種：采用6孔細胞培養板，每孔中加入5ml23%PluronicF-127和500條 二齡根結線蟲混勻，在膠將要凝固時將桃幼苗根置于孔中，保鮮膜包裹保濕培養。
[0031] (5)染色：在接種6、12、18、24、30、36、42、48h后取根尖（約I. 5cm)，每個時期4個 重復，放于盛有50ml自來水的燒杯中，加入次氯酸鈉至1. 5%，處理4-6min，適當攪拌；根尖 用自來水沖洗30-45s，后浸泡在自來水中15min，去除殘留的次氯酸鈉；根尖用濾紙吸干表 面水分，然后放于盛有30ml水和Iml染色劑（3. 5g酸性品紅，250ml乙酸，750ml蒸餾水） 的燒杯中，煮沸30s;冷卻至室溫，多余的染色劑用流水沖掉，后將根尖放于20-30ml的酸化 甘油中（甘油中滴加2-3滴5mol/lHcl)，煮沸后冷卻；根尖可壓在載玻片上觀察。取根尖 后，將植株根系插入23%PluronicF-127中，仍能存活長出側根，可以用于移栽。
[0032](6)統計鑒定：顯微鏡下隨機統計三個視野內線蟲數量，根據侵染數量界定植物 的抗病性。統計結果見表1，可以看出在接種30h左右侵染數量達到最高，根據此時期的侵 染數量確定植物的抗、感性是最為準確的時期。抗、感材料間侵染數量差異顯著，表明此方 法可以用于植物的根結線蟲抗性鑒定。
[0033] 表1抗、感材料不同時期線蟲侵染數量比較
[0034]
[0035] 以上所述，僅為本發明最佳實施方式，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明 披露的技術范圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的 保護范圍。
【主權項】
1. 一種桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 育苗：將桃種子低溫砂藏備用； (2) 二齡根結線蟲的分離：將感染根結線蟲的番茄根打碎，分別過20、100、200、500目 網篩，收集500目網篩上的蟲卵，通過蔗糖浮選法除雜、濃縮蟲卵，將濃縮的蟲卵倒于鋪有 一層200目網篩和兩層濾紙的培養皿中，3d后收集二齡根結線蟲； (3) 23%Pluronic F-127 的制備：稱23gPluronic F-127加入80ml 4°C預冷的無菌水， 適當攪拌，放于4°C冰箱中融化； ⑷接種：采用6孔細胞培養板，每孔中加入5ml 23% Pluronic F-127和500條二齡 根結線蟲混勻，在膠將要凝固時將桃幼苗根置于孔中，保鮮膜包裹保濕培養； (5) 染色：在接種30h后取根尖采用次氯酸鈉-酸性品紅-甘油法染色，染色后壓片； (6) 統計鑒定：顯微鏡下統計線蟲數量，根據侵染數量界定植物的抗病性。2. 根據權利要求1所述的桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法，其特征在于，所 述桃種子低溫砂藏3-4個月后發芽，接種時取出。3. 根據權利要求1所述的桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法，其特征在于，在 所述步驟（2)中收集的蟲卵經3000r/min離心3min棄部分上清增加蟲卵濃度，顯微鏡下計 算線蟲濃度，達到每100 U 1 100條，分離后當天接種。4. 根據權利要求1所述的桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法，其特征在于，在 所述步驟（3)中Pluronic F-127是一種共聚物，其23%水溶液在15°C以下為液態，以上為 固態，根結線蟲在其中自由移動，且無毒性。5. 根據權利要求1所述的桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法，其特征在于，在 所述步驟（5)中取根尖后，將植株根系插入23% Pluronic F-127中，仍能存活長出側根，用 于移栽。6. 根據權利要求1所述的桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法，其特征在于，在 所述步驟（5)中次氯酸鈉-酸性品紅-甘油法染色過程如下： 1) 洗凈根，取長為1.5cm的根尖放于盛有50ml自來水的燒杯中，加入次氯酸鈉至 1. 5%，處理4_6min，適當攪拌； 2) 根尖用自來水沖洗30-45s，后浸泡在自來水中15min，去除殘留的次氯酸鈉； 3) 根尖用濾紙吸干表面水分，然后放于盛有30ml水和Iml染色劑的燒杯中，煮沸30s ; 4) 冷卻至室溫，多余的染色劑用流水沖掉，后將根尖放于20-30ml的酸化甘油中，煮沸 后冷卻； 5) 根尖壓在載玻片上觀察。
【專利摘要】本發明公開了一種桃砧木抗南方根結線蟲離體快速篩選方法，該方法包括以下步驟：育苗；二齡根結線蟲的分離；23％Pluronic F-127的制備；接種：采用6孔細胞培養板，每孔中加入5ml 23％Pluronic F-127和500條二齡根結線蟲混勻，在膠將要凝固時將桃幼苗根置于孔中，保鮮膜包裹保濕培養。染色：在接種30h后取根尖采用次氯酸鈉-酸性品紅-甘油法染色，染色后壓片。統計鑒定：顯微鏡下統計線蟲數量，根據侵染數量界定植物的抗病性。本發明設計新穎，操作簡單，安全方便，解決了試驗中植物根結線蟲抗性鑒定不穩定，歷時長，統計復雜的問題。
【IPC分類】A01G7/00
【公開號】CN104969782
【申請號】CN201510353730
【發明人】王力榮, 李海炎, 曹珂, 朱更瑞, 王新衛, 方偉超, 陳昌文
【申請人】中國農業科學院鄭州果樹研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年6月22日