專利名稱：吳屯楊葉片組織培養獲得再生植株的方法
技術領域：
本發 明屬于林業繁殖技術領域，涉及以部分組織進行無性繁殖的技術。具體涉及 以樹葉組織培養進行再生植株的技術。
背景技術：
林業是國民經濟的基礎產業，在改善生態環境、維護生態平衡、實現可持續發展中 具有不可替代的作用。隨著我國荒漠化鹽漬化和凍害的不斷加劇，培育抗逆品種是實現擴 大種植面積，降低鹽堿災害，緩解土地矛盾的有效途徑之一，同時也是提高生態效益和經濟 效益的有效途徑。近年來，國內外相繼推出一批速生、抗旱、耐鹽堿、抗病蟲害的楊樹雜交 種、轉基因品種等，大大推動了我國林業技術的發展。1983年初，課題組在遼寧西部新民縣大柳屯鄉吳屯村發現了一種被當地老百姓稱 之為“吳屯楊”(Populus wutunensis)的楊樹無性系，在當地的自然環境下高徑生長表現優 異。經過多年繁育、盆栽和實地對比試驗以及有關專家認定，吳屯楊具有繁殖容易，育苗、造 林成活率高，根系發達，適應性強，生長速度快，抗干旱，耐鹽堿，耐瘠薄，樹干通直，材質優 良，速生豐產等特點，是優良天然雜交種，可用于營造防護林，大、小徑階用材林等，是一種 速生抗性強的樹種，在沙壤土、鹽堿地上生長良好，可以在沿海及內陸鹽堿地上的造林生產 中推廣使用。2008年12月，該品種通過了遼寧省林木品種審定。建立高效的組培再生體 系，對吳屯楊今后的遺傳改良和遺傳轉化奠定了基礎。
發明內容
本發明旨在發明一種吳屯楊葉片組織培養獲得再生植株的方法。本發明直接用葉 片作為外植體，取材方便。組織培養技術的成功不僅出取決于植物本身的遺傳特性，還需要適宜的培養基種 類、激素種類及濃度，以及恰當的培養溫度、適度和光照等條件。不同植物品種對組織培養 條件的要求均有所不同。本方面的技術方案是吳屯楊組培苗方法包括外植體消毒、分化培 養、抽莖及壯苗培養、生根培養來實現再生植株幼苗。本發明是通過如下步驟實現的(1)外植體消毒選用未木質化的健康嫩葉為外植體，用70%的酒精消毒30s后， 再用0. 的升汞浸泡6-8min，然后在無菌條件下用無菌水清洗5次，用無菌濾紙吸干。(2)分化培養將葉片延垂直主脈切2-4個切口，切口深達主脈，正面向上，放入分 化培養基中(分化培養基為MS+6BA0. 8-1. 2mg/L+NAA0. 1-0. 2mg/L)，先暗培42_54h，然后 放在培養架上光照培養，培養30天左右即可長出大量不定芽。(3)抽莖及壯苗培養接入抽莖培養基中(抽莖培養基為MS+6BA1. Omg/ L+NAAO. 15mg/L+GA30. 8-1. 5mg/L)，以促進莖的伸長生長，待不定芽長到2cm左右后，將其移 入到壯苗培養基(壯苗培養基為MS+蔗糖15-25g/L+瓊脂6. 5g/L)中，使其生長為莖干粗 壯的無根苗。
(4)生根培養待苗長到3cm左右時接入到生根培養基(生根培養基為1/2MS+IBA0. 15-0. 25mg/L+NAA 0. 02-0. 04mg/L)中，培養三周左右即可獲得主根粗壯，側根
豐富的幼苗。以上培養步驟中分化、抽莖培養基中加入30g/L蔗糖，壯苗培養基中加入 15-25g/L的蔗糖，生根培養基中加入15g/L的蔗糖。所有培養基均加入6. 5g/L的瓊 月旨，其PH為5. 8，培養室溫度25士2°C，除步驟2中暗培步驟外，其它培養的光照強度 1500-2000Lx，光照時間 13-15h/d。MS為基本培養基的一種，是Murashige and Skoog Stock的簡稱(下同)； 6-BA為6-芐氨基嘌呤，是6-benzylaminopurine的簡稱(下同)；NAA為α -萘乙酸，是 α -Naphthaleneacetic acid 的簡稱(下同)；GA3 為赤霉素，是 Gibberellic acid 的簡稱 (下同)；IBA為吲哚丁酸，是indolebutyric acid的簡稱(下同)。本發明突出優點是操作簡單，取材方便且材料豐富，可有效提高吳屯楊組織培養 獲得再生植株的效率，對其以后遺傳改良和遺傳轉化具有重要意。
圖1 外植體誘導的叢生芽。兩周左右后在葉片切口處開始出現不定芽。圖2:外植體誘導的叢生芽。抽莖培養中，不定芽迅速伸長生長情況。圖3 為誘導不定芽生根。莖干粗壯的幼苗接種到生根培養基，一周左右就可以看 到根源基突起，培養三周左右即可獲得粗壯的根。
具體實施例方式實施例1(1)外植體消毒選用未木質化的健康嫩葉為外植體，先將外植體用清水清洗表 面灰塵，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺上用70%的酒精消毒30s后用無菌水清洗一 次，再用0. 的升汞消毒7min，然后在無菌條件下用無菌水清洗5次，用無菌濾紙吸干。(2)分化培養將葉片延垂直主脈切2-4個切口，切口深達主脈，正面向上，放入分 化培養基中(分化培養基為MS+6BA1. 0mg/L+NAA0. 15mg/L)，先暗培48h，然后放在培養架 上光照培養，4d后葉片普遍卷曲，切口處增厚，長出淡綠色的愈傷組織，大約兩周左右后在 葉片切口處開始出現不定芽(圖1)，30d后統計結果，不定芽分化率為93. 3%。(3)抽莖及壯苗培養將叢生芽連同外植體一同移入到抽莖培養基中(抽莖培養 基為MS+6BA1. 0mg/L+NAA0. 15mg/L+GA31. 0mg/L)，不定芽迅速伸長生長(圖2)，待不定芽 長到2cm左右后，將其移入到壯苗培養基(壯苗培養基為MS+蔗糖20g/L+瓊脂6. 5g/L) 中，使不定芽生長的更加健壯。(4)生根培養待苗長到3cm左右時選擇莖干粗壯的幼苗接種接入到生根培養基 (生根培養基為d/^MS+IBAO. 20mg/L+NAA0. 03mg/L)中，一周左右就可以看到根源基突起， 培養三周左右即可獲得健壯的根(圖3)。30d后統計結果，生根率達98.0%。以上培養步驟中分化、抽莖培養基中加入30g/L蔗糖，壯苗培養基中加入20g/L 的蔗糖，生根培養基中加入15g/L的蔗糖。以上培養基中均加入6. 5g/L的瓊脂，pH5.8，培 養室溫度25°C，除步驟2中暗培步驟外，其它培養的光照強度2000Lx，光照時間14h/d。
實施例2(1)外植體消毒采集未木質化的健康嫩葉為外植體，先將外植體用清水清洗表 面灰塵，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺上用70%的酒精消毒30s，用
無菌水清洗一次，再用0. 的升汞消毒6min，然后用無菌水清洗5次，取出后用 無菌濾紙吸干。(2)分化培養將葉片延垂直主脈切2-4個切口，切口深達主脈，正面向上，接入分 化培養基中(分化培養基為MS+6BA0. 8mg/L+NAA0. lmg/L)，先暗培42h，然后放在培養架上 光照培養，大約兩周左右后在葉片切口處開始出現不定芽，30d后統計結果，不定芽分化率 為 86. 7%。(3)抽莖及壯苗培養將叢生芽連同外植體一同移入到抽莖培養基中(抽莖培養 基為MS+6BA1. 0mg/L+NAA0. 15mg/L+GA30. 8mg/L)，不定芽迅速伸長生長，待不定芽長到2cm 左右后，將其移入到壯苗培養基(壯苗培養基為MS+蔗糖25g/L+瓊脂6.5g/L)中，使不定 芽生長的更加健壯。(4)生根培養待苗長到3cm左右時，選擇莖干粗壯的幼苗接種接入到生根培養基 (生根培養基為1/2MS+IBA0. 25mg/L+NAA0. 04mg/L)中，一周左右就可以看到根源基突起， 培養三周左右即可獲得健壯的根(圖3)。30d后統計結果，生根率達92.0%。以上培養步驟中分化、抽莖培養基中加入30g/L蔗糖，壯苗培養基中加入25g/L 的蔗糖，生根培養基中加入15g/L的蔗糖。以上培養基均加入6. 5g/L的瓊脂，pH5.8，培養 室溫度27°C，除步驟2中暗培步驟外，其它培養的光照強度2000Lx，光照時間13h/d。實施例3(1)外植體消毒采集未木質化的健康嫩葉為外植體，先將外植體用清水清洗表 面灰塵，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺上用70%的酒精消毒30s，用無菌水清洗一次， 再用0. 的升汞消毒8min，然后用無菌水清洗5次，取出后用無菌濾紙吸干。(2)分化培養將葉片延垂直主脈切2-4個切口，切口深達主脈，正面向上，接入分 化培養基中(分化培養基為MS+6BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L)，先暗培養54h，然后放在培養架 上光照培養，大約兩周左右后在葉片切口處開始出現不定芽，30d后統計結果，不定芽分化 率為88. 9%。(3)抽莖及壯苗培養將叢生芽連同外植體一同移入到抽莖培養基中(抽莖培養 基為MS+6BA1. 0mg/L+NAA0. 15mg/L+GA31. 5mg/L)，不定芽迅速伸長生長，待不定芽長到 2cm左右后，將其移入到壯苗培養基(壯苗培養基為MS+蔗糖15g/L+瓊脂6.5g/L)中，使 不定芽生長的更加健壯。(4)生根培養待苗長到3cm左右時，選擇莖干粗壯的幼苗接種接入到生根培養 基(生根培養基為d/^MS+IBAO. 15mg/L+NAA 0. 02mg/L)中，一周左右就可以看到根源基突 起，培養三周左右即可獲得粗壯的根(圖3)。30d后統計結果，生根率達94.0%。以上培養步驟中分化、抽莖培養基中加入30g/L蔗糖，壯苗培養基中加入15g/L 的蔗糖，生根培養基中加入15g/L的蔗糖。以上培養基均加入6. 5g/L的瓊脂，pH5.8，培養 室溫度23°C，除步驟2中暗培步驟外，其它培養的光照強度1500Lx，光照時間15h/d。
權利要求
吳屯楊葉片組織培養獲得再生植株的方法，其特征在于通過如下步驟實現的(1)外植體消毒選用未木質化的健康嫩葉為外植體，用70％的酒精消毒30s后，再用0.1％的升汞浸泡6 8min，然后在無菌條件下用無菌水清洗5次，用無菌濾紙吸干；(2)分化培養將葉片延垂直主脈切2 4個切口，切口深達主脈，正面向上，放入分化培養基中，先暗培42 54h，然后放在培養架上光照培養，培養30天即可長出大量不定芽；所述分化培養基為MS+6BA0.8 1.2mg/L+NAA0.1 0.2mg/L；(3)抽莖及壯苗培養接入抽莖培養基中，以促進莖的伸長生長，待不定芽長到2cm后，將其移入到壯苗培養基中，使其生長為莖干粗壯的無根苗；所述抽莖培養基為MS+6BA1.0mg/L+NAA0.15mg/L+GA3 0.8 1.5mg/L，壯苗培養基為MS+蔗糖15 25g/L+瓊脂6.5g/L；(4)生根培養待苗長到3cm時接入到生根培養基中，培養三周即可獲得主根粗壯，側根豐富的幼苗；所述生根培養基為1/2MS+IBA0.15 0.25mg/L+NAA 0.02 0.04mg/L；以上培養步驟中分化、抽莖培養基中加入30g/L的蔗糖，壯苗培養基中加入15 25g/L的蔗糖，生根培養基中加入15g/L的蔗糖；以上所有培養基中均加入6.5g/L的瓊脂，其pH為5.8，培養室溫度25±2℃，除步驟2中暗培步驟外，其它培養的光照強度1500 2000Lx，光照時間13 15h/d；以上培養基中MS為基本培養基的一種，是Murashige and Skoog Stock的簡稱；6 BA為6 芐氨基嘌呤的簡稱；NAA為α 萘乙酸的簡稱；GA3為赤霉素的簡稱；IBA為吲哚丁酸的簡稱。
全文摘要
吳屯楊葉片組織培養獲得再生植株的方法。選用未木質化的健康嫩葉經洗滌、消毒后主脈切2-4個切口，放入分化培養基中，先暗培42-54h，然后放在培養架上光照培養，待培養30天左右后，將長出的不定芽接入到抽莖培養基中，以促進莖的伸長生長。待不定芽長到2cm左右，將其移入到壯苗培養基中，使其生長為莖干粗壯的無根苗。待苗長到3cm左右時接入到生根培養基中，培養三周即可獲得主根粗壯，側根豐富的幼苗。本發明突出優點是操作簡單，取材方便且材料豐富，可有效提高吳屯楊組織培養獲得再生植株的效率，對其以后遺傳改良和遺傳轉化具有重要意義。
文檔編號A01H4/00GK101953302SQ20101029135
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者姜國斌, 王穎, 金華, 閆艷華, 馬金龍 申請人:大連民族學院