專利名稱：：三倍體黃顙魚的生產方法
技術領域：
：本發明涉及一種魚類的養殖方法，特別是涉及一種三倍體黃顙魚的生產方法。
背景技術：
：黃顙魚[Pelteobagrusfulvidraco(Richardson)]俗禾爾黃臘丁，黃鼓魚等，屬鯰形目、鰉科、黃顙魚屬。其肉質細嫩，無肌間刺，蛋白質含量15.37%,氨基酸總量14.19%,必需氨基酸指數達73.34，高于鱖魚之外的其它魚類，且賴氨酸含量較高，超過雞蛋蛋白質標準，具很高的營養價值。同時因其肉性味甘、平、有祛風、利尿之功效，可用以主治水腫、喉痹腫痛等癥，有一定的藥用價值而深受消費者親睞。目前由于黃顙魚天然資源銳減，市場上黃顙魚價格逐年攀升(是普通魚價格的2一倍)，需求量很大，具有較好的市場前景。同時黃顙魚在日本、韓國、東南亞等國家也有巨大的市場潛力，是出口創匯的優良品種。但由于該魚生長速度慢、個體規格偏小，通常要兩年才能性成熟。加之該魚產卵量低，一年中分批多次產卵，從整體上影響其養殖產量，遠遠不能滿足市場的需求。為解決這些問題，國內學者進行了許多有益的嘗試，主要集中在養殖手段及養殖環境的優化方面，但從國內外水產動物研究的趨勢來看，三倍體技術應是最有潛力的一種方法。三倍體水產動物由于其不育性的特點，即性腺不能達到成熟并繁殖后代，因此沒有性成熟階段性腺發育的能量損耗，避免了性腺發育階段的生長停止和高死亡率。目前，三倍體水產動物在控制過度繁殖、加快生長速度等方面都顯示了良好的效果。目前三倍體技術在水產動物的應用主要集中在貝類上，多采用物理或化學方法，在魚類研究很少，尤其在黃顙魚上實行人工誘導產生三倍體，從而達到改良品種性狀，目前尚未有文獻和研究涉及，因此如何根據黃顙魚的特性，設計一種誘導方法，獲得三倍體黃顙魚，以提高黃顙魚的生長速度及養殖成活率，具有廣泛的經濟效益和社會效益
發明內容為解決現有技術中黃顙魚生長速度慢及成活率低的問題，本發明的目的在于提供一種三倍體黃顙魚的生產方法，采用該生產方法得到的黃顙魚具有生長速度快、成活率高的特性。本發明為實現上述目的采取的技術方案為，一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，將采用人工催產獲得的黃顙魚母本和父本進行人工授精，1015分鐘后，誘導得到三倍體黃顙魚，誘導持續時間1020分鐘。所述的人工催產受精是指將親本選育的黃顙魚經雌雄鑒別后，注射催情藥物，雌體注射量為0.20.5ml/尾，雄體注射量為雌體的一半，解剖法獲取精卵后進行人工授精。優選地，注射部位以背鰭基部注射為主，進針深度0.51.0cm。注射方式采用二次注射，第一針藥量為全劑量的1/4,藥液量為lmL,第二針為全劑量的3/4，藥液量為lmL。二次注射兩針時間間隔為1012h。所述的催情藥物可選自絨毛膜促性腺激素(HCG)+馬來酸地歐酮(DOM)、促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)+DOM、HCG+LHRH-A2+DOM三種組合的任意一種。本發明采用的誘導方法可以為物理誘導、化學誘導或兩者的結合。口所述的物理誘導是指采用冷休克誘導或熱休克誘導，其中冷休克誘導溫度控制在04"C，熱休克溫度控制在3037°C。所述的化學誘導是指采用化學誘導劑進行誘導，化學誘導劑可選自細胞松弛素B(CB)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素和聚乙二醇(PEG)的任意一種。優選的，采用6-DMAP誘導黃顙魚產生三倍體。6-DMAP濃度為300600pmol/L;誘導持續時間為1020miiu本發明的進一步方案為誘導得到三倍體黃顙魚后，利用染色體核型分析、細胞流式儀等技術測定上述魚體的染色體倍數，鑒別、篩選出三倍體黃顙魚進行培育a本發明的有益效果為1、本發明通過對人工授精的時間控制，同時采用物理或化學方法迸行誘導，并通過控制誘導持續時間，抑制第二極體釋放的時間，從而大大提高三倍體黃顙魚的誘導率和成活率，據實驗統計，所獲得的三倍體黃顙魚的人工誘導率可達50%以上，成活率達80%以上。2、采用本發明所述方法培育的三倍體黃顙魚，具有生長速度快、個體規格大、養殖成活率高，抗病能力強、肉味鮮美等優點，具有良好的經濟效益和社會效益。圖1為本發明的工藝流程圖2為各因素對三倍體誘導的效應對比圖。具體實施例方式參照圖1所示，本發明所述的三倍體黃顙魚的生產方法如下1.1材料準備l丄l樣品黃顙魚(尸e/teo^gntf/w/vWracc^取自紹興農貿市場。肉眼觀察，性腺發育良好。1.1.2試劑誘導試劑6-二甲基氨基嘌呤(6-Dimethylaminopurine，簡稱6-DMAP)，為美國Sigma公司產品。分子式0^91^5，分子量163.2，藥品純度高于98%。基因組小量抽提試劑盒(包括CdlLysisSolutkMi;Prec^itatiooSolutkm;TE(p胸.0);12mol/LNaCl;ProteinaseK;RnaseA)，為生物工程(上海)有限公司產品。113儀器水箱數個，充氣泵，解剖器具1套，1.5ml消化管，移液槍，電子分析天平(JA5003,用于稱量微量的試劑，最大量為500g)，數顯恒溫水浴鍋(HH-6,恒溫水浴)，高速微量冷凍離心機(LGR-16-W)，核酸蛋白定量儀，比色管。1.2方法1.2.1雌雄鑒別、性比、注射部位和藥量雌雄鑒別主要看生殖孔，即有生殖乳突為3，無生殖乳突為？。雌雄比一般為l:l。注射部位以背鰭基部注射為主，進針深度0.51.0cm，使用二次注耽第一針藥量為全劑量的l/4，藥液量為lmL，第二針為全劑量的3/4，藥液量為lmL。^為？劑量的1/2。二次注射兩針時間間隔為1012h。1.2.2不同催情藥物的比較設3個組合絨毛膜促性腺激素(HCG)+馬來酸地歐酮(DOM);促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)+DOM;HCG+LHRH-A2+DOM。1.2.3精卵解剖法獲取精卵，并進行人工授精。1.2.4三倍體誘導用6-DMAP誘導黃顙魚產生三倍體。進行正交試驗6-DMAP濃度，設300、450和600nmoI/L;誘導時機(即精卵混合后的時間)，設10、和30min;誘導持續時間，設10、15、20min。試驗平行重復二次。決定三倍體誘導率的三因素主次順序和最優水平組合以直觀分析法得出o1.2.5黃顙魚基因組DNA的提取取冷凍的受精卵30顆碾碎，收集到1.5mL離心管中，用200uLTE懸浮。200nL樣品加400LCellLysisSokrtkxi混勻，再力qA6uLProtdnaseK混勻，置于65"C水浴2h。其間上下混勻幾次。加入600uL氯仿混勻，不能太劇烈，以保證DNA的完整性。在臺式離心機上，10000r/min,室溫離心2分鐘。此時應分J^三層，基因組DNA在上層中。取500pL上層清液，置于無菌1.5mL離心管中。加入500nLPrecipitationSolution混勻，室溫放置2分鐘。10000r/min，離心2分鐘。吸去上清，立即加入100mL，1.2mol/LNaCl，請輕振蕩直至DNA樣品完全溶解，加入3^RnaseA，置于37-C5-10分鐘，以去除RNA。加入300nL冰冷乙醇，-20'C放置10分鐘。10000r/min，離心5-8分鐘。吸走或倒掉乙醇，用70%乙醇洗一次。倒置室溫干燥10分鐘。DNA用100pLTE溶解。1.2.7倍性檢査DNA的含量鑒定由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在紫外260nm波長處有最大吸收峰，這個性質可用于核酸的定量測定。而普通三倍體細胞的DNA含量是二倍體的1.5倍，因此可以通過DNA的含量區分出二倍體和三倍體。實驗所得的提取物中DNA含量的定性與定量測定均在核酸蛋白定量儀(SmartSpecplus,主要用于測定抽提的核酸OD值)上進行。吸取10nlDNA樣品，轉入比色杯中，用超純水校正零點。吸收波長取260nm和280nm，以260nm處的吸收值作為計算DNA含量參數。在波長為260nm的光程為，一個吸收單位(1A260)相當于雙鏈DNA濃度為50pg/ml，單鏈DNA為33ng/ml，單鏈RNA為40pg/ml，寡核甘酸為2030pg/ml。DNA的含量計算公式如下.-所提DNA樣品濃度0ig/mi;K)D260x50xDNA稀釋倍數。DNA產量(nghDNA濃度x樣品的體積(ml)13.實驗結果及分析表l注射過HCG+LHRH-A2的三倍體誘導率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表l中可以看出，6-DMAP濃度較低時，適當延長誘導時機可以提高三倍體的誘導率，但是當濃度達到一定程度時，如果再延長誘導時機誘導率反而會變低，可能由于高濃度的藥物對受精卵產生了毒性，造成了誘導率下降。雖然可以產生一定百分比的三倍體，但是都沒有達到50%，也可能說明HCG+LHRH-A2催產率并不高。表2注射過HCG+DOM的三倍體誘導率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表2中可Bl看出，6-DMAP誘導三倍體黃顙魚時有個閾值，其濃度低于或高于這個閾值時，三倍體的誘導率都會有所下降。可能原因是當濃度低于閾值時，不能有效抑制住極體的釋放，所以多倍體產生的幾率變小；當濃度高于閾值時，對受精卵產生了毒害，故造成了誘導率下降。表2中誘導率較高，可能說明HCG+DOM的催產率效果比較好。表3注射過LHRH-A2+DOM的三倍體誘導率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表3中可以看出，三倍體的誘導情況和表2基本一致，6-DMAP誘導三倍體黃顙魚時有個閾值，其濃度低于或高于這個閾值時，三倍體的誘導率都會有所下降。另外適當延長誘導時機可以提高三倍體的誘導率。表3中三倍體誘導率處于中間水平，可能說明LHRH-A2+DOM催產效果一般。綜合表I、2、3，本實驗得到的三倍體誘導率各影響因素效應對比如圖2，從圖2中可以看出，影響三倍體誘導率三個因素中1、6-DMAP的濃度是誘導三倍體的一個重要因素，在抑制受精卵的極體釋放有個閾值。若其濃度低于這個閾值，不管誘導持續時間有多長，都不能有效抑制住極體的釋放，都不能使之產生多倍體。只有當6-DMAP濃度達到閾值后,并且誘導持續時間達到一定的效應時間時才能抑制住極體的釋放，才能產生多倍體。若是抑制第二極體釋放，這個"一定的效應時間"則應為釋放出第一極體后開始到釋放出第二極體所需要的時間；若誘導濃度大大超過閾值，則所誘導的受精卵雖然能產生多倍體，但必然會出現胚胎的孵化率很低和幼體的畸形率很高的現象。因此超出一定的濃度范圍三倍體誘導率會明顯降低，所以適宜的藥物濃度是保證三倍體誘導成功的前提。2、誘導時機人工受精后10min為誘導時機獲得的誘導效果較好。誘導魚類三倍體產生的機制就是抑制受精卵第二極體的排出，使得受精卵中保留兩套雌核染色體和一套雄核染色體而成為三倍體，因此，只有將誘導處理起始時間準確定位在第二極體排出之前，才有可能獲得較好的誘導率，但由于第二極體排出時間十分短暫，而且受精卵的發育不完全同歩，這就使得處理起始時間的準確選擇有一定的難度。3、誘導持續時間對黃顙魚受精卵持續誘導15min的效果明顯好于誘導10min和20min的效果，過短的處理時間對抑制受精卵第二極體的排出的效果不明顯，導致三倍體誘導效率不高。而過長的處理時間不但不能提高三倍體誘導率，反而會對受精卵造成嚴重損傷，導致胚體大量畸形，影響孵化率。可見，在確定了適宜的處理溫度和開始處理時間后，處理持續時間的長短將直接影響受精卵的誘導率。權利要求1、一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，將采用人工催產獲得的黃顙魚母本和父本進行人工授精，10～15分鐘后，誘導得到三倍體黃顙魚，誘導持續時間10～20分鐘。2、如權利要求1所述的一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，所述的人工催產受精是指將親本選育的黃顙魚經雌雄鑒別后，注射催情藥物，雌體注射量為0.20.5ml/尾，雄體注射量為雌體的一半，解剖法獲取精卵后進行人工授精。3、如權利要求2所述的一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，注射部位以背鰭基部注射為主，進針深度0.51.0cm。注射方式采用二次注射，第一針藥量為全劑量的1/4,藥液量為lmL，第二針為全劑量的3/4，藥液量為lmL。二次注射兩針時間間隔為1012h。4、如權利要求2或3所述的一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，所述的催情藥物可選自絨毛膜促性腺激素(HCG)+馬來酸地歐酮(DOM)、促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)+DOM、HCG+LHRH-A2+DOM三種組合的任意一種。5、如權利要求1所述的一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，所述誘導方法可以為物理誘導、化學誘導或兩者的結合。6、如權利要求5所述的一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，所述的物理誘導是指采用冷休克誘導或熱休克誘導，其中冷休克誘導溫度控制在04°C，熱休克溫度控制在3037'C。7、如權利要求5所述的一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，所述的化學誘導是指采用化學誘導劑進行誘導，化學誘導劑可選自細胞松弛素B(CB)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素和聚乙二醇(PEG)的任意一種。8、如權利要求7所述的一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，優選的，采用6-DMAP誘導黃顙魚產生三倍體。6-DMAP濃度為300600nmol/L;誘導持續時間為1020min。9、如權利要求1所述的一種三倍體黃顙魚的生產方法，其特征在于，誘導得到三倍體黃顙魚后，利用染色體核型分析、細胞流式儀等技術測定上述魚體的染色體倍數，鑒別、篩選出三倍體黃顙魚進行培育。全文摘要本發明公開了一種三倍體黃顙魚的生產方法，屬于魚類養殖
技術領域：
，將采用人工催產獲得的黃顙魚母本和父本進行人工授精，10～15分鐘后，誘導得到三倍體黃顙魚，誘導持續時間10～20分鐘。誘導得到三倍體黃顙魚后，利用染色體核型分析、細胞流式儀等技術測定上述魚體的染色體倍數，鑒別、篩選出三倍體黃顙魚進行培育。本發明通過對人工授精的時間控制，同時采用物理或化學方法進行誘導，并通過控制誘導持續時間，抑制第二極體釋放的時間，從而大大提高三倍體黃顙魚的誘導率和成活率，據實驗統計，所獲得的三倍體黃顙魚的人工誘導率可達50％以上，成活率達80％以上。文檔編號A01K61/00GK101305698SQ20081006290公開日2008年11月19日申請日期2008年7月4日優先權日2008年7月4日發明者沈文英,文羅,鄧先余申請人:紹興文理學院;羅文;沈文英