專利名稱：一種防治鐵皮石斛疫病發酵液的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，尤其涉及到一種防治鐵皮石斛疫病發酵液的制備方法。
背景技術：
鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是傳統的中藥材，也作為保 健品的原料，有巨大的市場需求和重要的經濟價值。目前野生資源已瀕臨枯竭，人工栽培鐵 皮石斛已越來越受到重視。然而，在人工栽培條件下鐵皮石斛經常受到石斛疫病的危害。
鐵皮石斛疫病是由疫霉菌引起的，經鑒定為煙草疫霉菌 Phytophthoranicotianae。在不同苗齡上發生，病原菌引起根腐、莖基部腐和頂枯等癥狀。 鐵皮石斛疫病是一種毀滅性的病害，石斛栽培田間一旦發生，常造成嚴重的經濟損失，然 而，在自然條件下絕沒有觀察到石斛疫病的發生。 一般發生在8月上旬，危害一直持續到9 月底或10月中旬。疫病主要為害當年移植的石斛苗，引起死亡。 植物病害拮抗細菌的篩選和應用是植物病害防治的研究熱點。拮抗細菌及其代謝 產物的開發利用，以及篩選培養新型、高效、穩定、適生性強的拮抗細菌是今后生防菌發展 的趨勢。因此，對防治鐵皮石斛疫病的發酵液及其制備方法，具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種防治鐵皮石斛疫病的發酵液。 本發明提供的一種防治鐵皮石斛疫病的復合發酵液，其制備方法包括以下步驟
1)取大田鐵皮石斛基質，加入錐形瓶中，振蕩，靜置，將基質溶液依次稀釋到。
2)分別取稀釋液，滴加在牛肉膏蛋白胨平板上，用涂布棒涂勻。將制好的平板放置 恒溫培養箱中，培養。 3)將上述2)培養好的板上挑取單菌落，分別傳試管斜面，并進一步進行搖瓶培 養，得發酵液待用。 4)取長勢良好的鐵皮石斛疫病病原菌試管斜面一支，向試管斜面中加入無菌水， 刮鐵皮石斛疫病菌的孢子，吸取孢子懸液加入無菌水中，振蕩，使之成為分散均勻的孢子懸 液。吸取均勻的鐵皮石斛病原菌孢子懸液于無菌平皿中，再倒入培養基，制成鐵皮石斛疫病 菌混菌平板。 5)在鐵皮石斛疫病菌制成的混菌平板上分別貼上無菌的濾紙片，每個平板貼5 個，在5個濾紙片上分別滴加步驟3)中的細菌單菌落制成的發酵液，培養后，根據形成抑菌 圈的情況挑選拮抗菌菌株。 6)將所選出發菌，進行單一菌發酵液的制備，考察對鐵皮石斛疫病病菌拮抗效果。
7)對單一菌株發酵液及不同濃度酵液進行兩兩復合的發酵制備，得出拮抗菌Be和 B8復合發酵液拮抗能力最強。 8)分別將B6菌和B8菌接種到三角瓶液體培養基中，在3-35°C、 pH為7. 0-8. 0下 培養24-48小時，得到種子液；分別將菌種B6和B8經活化培養后，分別接種在培養液，保持在一定溫度下進行靜置培養；分別將拮抗菌B6和B8培養液經離心、過濾除菌(瓶頂過濾裝 置)，冷凍干燥后配成溶液。將所得Be和Bs的發酵液按比例進行混合即得復合發酵液。將 所制備的發酵液在低溫下進行冷藏保存。 優選地，所述步驟8)B6菌和B8菌的三角瓶液體培養基配方為牛肉膏蛋白胨 4-6g，蛋白胨8-12g， NaC14-6g，用水定容至1000mL。 優選地，所述步驟8)菌種Be培養的最佳條件為最優溫度為27-3rC，最適堿度為 ra = 7. 1-7. 6，培養時間為48h。其中B8的培養條件為最優溫度為26-32t:，最適堿度為 PH = 7. 3-7. 8，最佳培養時間為48h。 優選地，所述步驟8)菌種B6和B8經活化培養后，分別接種在牛肉膏蛋白胨培養 液，接種量為每100mL放入菌餅(小=7mm)3片，于25。C靜置培養8d。
優選地，所述步驟8)拮抗菌培養液經離心的條件為溫度為4t:，轉速15000r/ min，離心時間為15min、冷凍干燥后配成7mg/mL-8mg/mL的溶液。 優選地，所述步驟8)中Be和Bs最優復合發酵液的混合比例為(0.8-1) : l時的
抑菌能力最強。
優選地，所述步驟8)保存是指在溫度為l-4t:下進行冷藏保存。 本發明主要采用以菌治菌的防治方法，即活體微生物農藥防治法，利用種植鐵皮 石斛的土壤作為原材料，從中篩選出代謝產物對鐵皮石斛疫病具有較強抑制作用的菌株， 然后進行發酵液的制備。 本發明為提供了一種防治鐵皮石斛疫病的復合發酵液，為開發鐵皮石斛疫病微生 物農藥的制備，提供了一條思路。本發明在鐵皮石斛疫病防治領域具有廣闊的利用前景。
具體實施例方式
為了使本技術領域的人員更好地理解本發明方案，下面結合實施方式對本發明所
述的防治鐵皮石斛疫病發酵液的制備方法作進一步的詳細說明。 防治鐵皮石斛疫病的菌種的篩選方法，具體包括以下步驟 1)取大田鐵皮石斛基質，加入錐形瓶中，振蕩，靜置，將基質溶液依次稀釋到。 2)分別取稀釋液，滴加在牛肉膏蛋白胨平板上，用涂布棒涂勻。將制好的平板放置
恒溫培養箱中，培養。 3)將上述2)培養好的板上挑取單菌落，分別傳試管斜面，并進一步進行搖瓶培 養，得發酵液待用。 4)取長勢良好的鐵皮石斛疫病病原菌試管斜面一支，向試管斜面中加入無菌水， 刮鐵皮石斛疫病菌的孢子，吸取孢子懸液加入無菌水中，振蕩，使之成為分散均勻的孢子懸 液。吸取均勻的鐵皮石斛病原菌孢子懸液于無菌平皿中，再倒入培養基，制成鐵皮石斛疫病 菌混菌平板。 5)在鐵皮石斛疫病菌制成的混菌平板上分別貼上無菌的濾紙片，每個平板貼5 個，在5個濾紙片上分別滴加步驟3)中的細菌單菌落制成的發酵液，培養后，根據形成抑菌 圈的情況挑選拮抗菌菌株。 6)將所選出發菌，進行單一菌發酵液的制備，考察對鐵皮石斛疫病病菌拮抗效果， 并分別對不同濃度發酵液進行分析。
7)對單一菌株發酵液及不同濃度酵液進行兩兩復合的發酵制備，考察出更優的拮 抗菌復合發酵液。 所述步驟1)中基質溶液稀釋到105倍和106倍溶液。 所述步驟2)中恒溫培養箱的培養溫度為36°C ，培養時間為48h。 所述步驟3)發酵液是指將篩選出菌種經活化培養后，接種在培養基，靜置培養，
拮抗菌培養液經離心、過濾除菌，冷凍干燥后配成10mg/mL的溶液。 所述步驟4)吸取孢子懸浮液約為lmL，加入無菌水量為29mL。 所述步驟5)倒入的培養基為PDA培養基。選出15種具有拮抗效果菌株BrB15。 所述步驟6)考察對鐵皮石斛疫病病原菌的拮抗效果，采用的是抑菌圈的方法，以
抑菌圈直徑的大小來衡量拮抗作用。 所述步驟7)最優的復合發酵液為B6和B8兩種發酵液體的復合發酵液。其發酵濃
度分別為7mg/mL-8mg/mL，混合比例體積比為(0.8-1) : 1 防治鐵皮石斛疫病的發酵液的制備方法，具體包括以下步驟 1)分別將篩選出來的B6菌和B8菌接種到三角瓶液體培養基中，在3-35°C、 pH為
7. 0-8. 0下培養24-48小時，得到種子液; 2)分別將菌種B6和B8經活化培養后，分別接種在培養液，保持在一定溫度下進行 靜置培養。 3)分別將拮抗菌B6和B8培養液經離心、過濾除菌(瓶頂過濾裝置)，冷凍干燥后 配成溶液。 4)將步驟3)中所得B6和B8的發酵液進行復合按一定比例進行復核，進行抑菌測 定。 5)將優選出的拮抗最強的復合發酵液進行保存。 所述步驟1)菌種B6培養的最佳條件為最優溫度為27-3rC，最適堿度為ffl = 7. 1-7. 6，培養時間為48h。其中B8的培養條件為最優溫度為26-32t:，最適堿度為PH = 7.3-7.8，最佳培養時間為48h。所述Be菌和Bs菌的三角瓶液體培養基配方為牛肉膏蛋白 胨4-6g，蛋白胨8-12g， NaC14-6g，用水定容至1000mL。 所述步驟2)菌種B6和B8經活化培養后，分別接種在牛肉膏蛋白胨培養液，接種量 為每100mL放入菌餅(小=7mm)3片，于25。C靜置培養8d。 所述步驟3)拮抗菌培養液經離心的條件為溫度為4°C ，轉速15000r/min，離心時 間為15min、冷凍干燥后配成7. 5mg/mL的溶液。 所述步驟4)中B6和B8最優復合發酵液的混合比例為(0. 8-1) : 1時的抑菌能力最強。 所述步驟5)保存是指在溫度為fC下進行冷藏保存。
權利要求
本發明所提供的一種防治鐵皮石斛疫病的發酵液及其制備方法，其特征在于篩選出的B6和B8兩種菌的復合發酵液，其混合比例為(0.8-1)∶1，發酵液的濃度為7mg/mL-8mg/mL。其中B6的培養條件為最優溫度為27-31℃，最適堿度為pH＝7.1-7.6。其中B8的培養條件為最優溫度為26-32℃，最適堿度為pH＝7.3-7.8。
2. —種防治鐵皮石斛疫病的發酵液及其制備方法，其特征在于包括以下步驟1) 取大田鐵皮石斛基質，加入錐形瓶中，振蕩，靜置，將基質溶液依次稀釋到。2) 分別取稀釋液，滴加在牛肉膏蛋白胨平板上，用涂布棒涂勻。將制好的平板放置恒溫 培養箱中，培養。3) 將上述2)培養好的板上挑取單菌落，分別傳試管斜面，并進一步進行搖瓶培養，得 發酵液待用。4) 取長勢良好的鐵皮石斛疫病病原菌試管斜面一支，向試管斜面中加入無菌水，刮鐵 皮石斛疫病菌的孢子，吸取孢子懸液加入無菌水中，振蕩，使之成為分散均勻的孢子懸液。 吸取均勻的鐵皮石斛病原菌孢子懸液于無菌平皿中，再倒入培養基，制成鐵皮石斛疫病菌 混菌平板。5) 在鐵皮石斛疫病菌制成的混菌平板上分別貼上無菌的濾紙片，每個平板貼5個，在5 個濾紙片上分別滴加步驟3)中的細菌單菌落制成的發酵液，培養后，根據形成抑菌圈的情 況挑選拮抗菌菌株。6) 將所選出發菌，進行單一菌發酵液的制備，考察對鐵皮石斛疫病病菌拮抗效果。7) 對單一菌株發酵液及不同濃度酵液進行兩兩復合的發酵制備，得出拮抗菌Be和B8復 合發酵液拮抗能力最強。8) 分別將B6菌和B8菌接種到三角瓶液體培養基中，在3-35°C、 pH為7. 0-8. 0下培養 24-48小時，得到種子液；分別將菌種B6和B8經活化培養后，分別接種在培養液，保持在一 定溫度下進行靜置培養；分別將拮抗菌B6和B8培養液經離心、過濾除菌(瓶頂過濾裝置)， 冷凍干燥后配成溶液。將所得Be和Bs的發酵液按比例進行混合即得復合發酵液。將所制 備的發酵液在低溫下進行冷藏保存。
3. 如權利要求2 —種鐵皮石斛疫病拮抗菌復合發酵液的制備方法，其特征在于，所述 步驟8)中86菌和88菌的三角瓶液體培養基配方為牛肉膏蛋白胨4-6g，蛋白胨8-12g，NaCl 4-6g，用水定容至1000mL。
4. 如權利要求2 —種鐵皮石斛疫病拮抗菌復合發酵液的制備方法，其特征在于，所述 步驟8)菌種B6培養的最佳條件為最優溫度為27-3rC，最適堿度為ra = 7. 17. 6，培養時 間為48h。其中B8的培養條件為最優溫度為26-32t:，最適堿度為ffl = 7. 37. 8，最佳培養 時間為48h。
5. 如權利要求2 —種鐵皮石斛疫病拮抗菌復合發酵液的制備方法，其特征在于，所述 步驟8)菌種B6和B8經活化培養后，分別接種在牛肉膏蛋白胨培養液，接種量為每100mL放 入菌餅(小=7mm)3片，于25。C靜置培養8d。
6. 如權利要求2 —種鐵皮石斛疫病拮抗菌復合發酵液的制備方法，其特征在于，所述 步驟8)拮抗菌培養液經離心的條件為溫度為4t:，轉速15000r/min，離心時間為15min、 冷凍干燥后配成7mg/mL-8mg/mL的溶液。
7. 如權利要求2 —種鐵皮石斛疫病拮抗菌復合發酵液的制備方法，其特征在于，所述步驟8)中86和88最優復合發酵液的混合比例為(0.8-1) : l時的抑菌能力最強。
8.如權利要求2 —種防治鐵皮石斛疫病的發酵液及其制備方法，其特征在于，所述步 驟8)保存是指在溫度為l-4。C下進行冷藏保存。
全文摘要
本發明所提供的鐵皮石斛疫病拮抗菌復合發酵液，其特征在于篩選出的B6和B8兩種菌的復合發酵液，其混合比例為(0.8-1)∶1，發酵液的濃度為7mg/mL-8mg/mL。其中B6的培養條件為生長溫度范圍為3-35℃，最優溫度為27-31℃，堿度范圍為pH＝5-8.5，最適堿度為pH＝7.1-7.6。其中B8的培養條件為生長溫度范圍為4-38℃，最優溫度為26-32℃，堿度范圍為pH＝5-8.5，最適堿度為pH＝7.3-7.8，本發明提供了一種對鐵皮石斛疫病病菌具有拮抗作用的菌種復合發酵液的制備方法，為開發鐵皮石斛疫病微生物農藥的制備，提供了一條思路。本發明在鐵皮石斛疫病防治領域具有廣闊的利用前景。
文檔編號A01P3/00GK101715789SQ200910155280
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月9日 優先權日2009年12月9日
發明者俞巧仙, 葉智根, 周術濤, 雷志力 申請人:浙江森宇實業有限公司