專利名稱：大型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基及其培養方法
技術領域：
本發明涉及一種適用于慈竹和綿竹等大型叢生竹的培養基和培養方法，具體為大 型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基及其培養方法。
背景技術：
目前國內外對竹子的運用范圍較多，尤其是用于做紙漿的大型叢生竹，所以對竹 子的需求量較大，但是培養大型叢生竹尤其是紙漿用竹時就出現了問題，以往竹的組織培 養研究多集中在觀賞竹的快繁上，大型叢生竹尤其是紙漿用竹的愈傷組織誘導和植株再生 難以培養，目前的國內外相關的資料上均未見報道。
發明內容
本發明正是針對以上技術問題，提供一種適用于大型紙漿用竹的體細胞無性系變 異、品種改良及利用基因工程技術進行外源基因的遺傳轉化的大型叢生竹愈傷組織誘導與 植株再生高效培養基及其培養方法。本發明的具體技術方案如下大型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基，包括MS培養基和愈傷組織誘 導與植株再生高效培養基，MS培養基按照以下原料制成a)大量元素(mg/L)硝酸鉀(KN03) 1900、硝酸銨(NH4N03) 1650、磷酸二氫鉀 (KH2P04) 170、硫酸鎂(MgS04. 7H20)370、氯化鈣(CaC12. 2H20) 440b)微量元素(mg/L)碘化鉀(KI)0.83、硼酸(H3B03)6. 2、硫酸錳 (MnS04. 4H20) 22. 3、硫酸鋅(ZnS04. 7 H20) 8. 6、鉬酸鈉(Na2Mo04. 2 H20) 0. 25、硫酸銅 (CuS04. 5 H20)0. 025、氯化鈷(CoC12)0. 025c)有機成分(mg/L)肌醇100、甘氨酸2、鹽酸硫胺素(VB1)0. 1、鹽酸吡哆醇 (VB6) 0. 5、煙酸(VB5 或 VPP) 0. 5d)鐵鹽(mg/L)乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA)37. 3、硫酸亞鐵 (FeS024. 7H20) 27. 8愈傷組織誘導與植株再生高效培養基配方，按照以下成分組成a)主培養基MS 基本培養基+KT 2mg/L+IBA 0. 4mg/L+2，4，5_T 2mg/Lb)A培養基(快速分化培養基):MS基本培養基+KT 2. 5mg/L+IAA0. 5mg/Lc) B培養基(快速生根培養基):MS基本培養基+IAA 0. 25mg/L+IBA 0. 4mg/LMS培 養基要求PH 5. 6-6.0，蔗糖30%，瓊脂7g/L。大型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基的制備方法，包括以下步驟a)母液的配置母液1 (50 X大量元素)500ml 母液稱取41. 25g NH4N03、47. 5g KN03、4. 25g KH2P04、9. 25g MgS04 7H20母液2(100 X) 250ml 母液稱取:llg CaC12 2H20
母液3 (棕色瓶)250ml 母液(100X)695mg FeS04 7H20、932. 5mgNa2-EDTA分別溶解，每個試劑溶于120ml水，用電爐或微波爐加熱，再混合定容，母液4(100 X微量元素)，250ml 母液稱取 557. 5mg MnS04 4H20、215mg ZnS04 7H20、205mgH3B04、20. 75mg KI、6. 25mg Na2Mo04 2H20、0. 625mg CuS04 5H20、0. 625mgCoC12 6H20母液5 (1000 X) 100ml 母液稱取lOmg硫胺酸 Bl、50mg 吡哆醇 B6、50mg 煙酸、200mg
甘氨酸b)激素的配置lmg/ml 2，4，5_T 稱取lOmg 2，4，5-T于干燥的容器內，加入無水乙醇至完全溶 解，用蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml NAA或IAA 稱取lOmg NAA或IAA于干燥的容器內，逐滴加入無水乙醇，至 完全溶解。用蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml KT 稱取lOmg KT于干燥的容器內，逐滴加入1M的HC1.至完全溶解，用蒸 餾水定容至10ml ；c) NaOH、HC1 溶液的配置配置100ml 5N NaOH、4N HC1用于調節PH值20g NaOH定容至100ml的蒸餾水中， 34. 48ml HC1定容至100ml的蒸餾水中；d) MS溶液的混合配制MS培養基時，每1000ml培養基取20ml母液1、10ml母液2、10ml母液3、10ml 母液4、lml母液5。分別依次加入到800ml蒸餾水中，混勻后加入30g蔗糖定溶至1000ml， 用 5N NaOH 調 PH 到 5. 6-6. 0 ；e)添加激素主培養基每1000ml MS 培養基中加入 2ml KT (lmg/ml)+0. 4ml IBA (lmg/ml)+2ml 2，4，5-T (lmg/ml)A 培養基每 1000ml MS 培養基中加入 2. 5ml KT (lmg/ml)+0. 5ml IAA (lmg/ml)B 培養基每 1000ml MS 培養基中加入 0. 4ml IBA (lmg/ml)+0. 25ml IAA (lmg/ml)瓊脂粉為0. 8%，即每1000ml MS培養基中8g瓊脂粉，加熱溶解后分裝至50ml三 角瓶內；f)高壓滅菌121度下滅菌15分鐘，放置1-2天后備用；g)外植體消毒將竹種子洗凈泡脹12小時，在超凈臺中用70%乙醇浸泡30s，無 菌水沖洗三次，0. 升汞浸泡30min，期間不斷震蕩，再用無菌水沖洗5_6次；h)愈傷組織誘導取胚接種于愈傷組織培養基中，暗培養7-10天后轉移至光照 下。12h. cf1光照條件下進行，光照強度20001x，溫度25-26°C。愈傷組織誘導同時可發生芽 分化和植株再生。為加速芽分化，可將有芽點的愈傷轉入快速分化培養基(A培養基)。該 培養基也可以誘導無芽點的胚性愈傷組織分化成苗；i)生根、壯苗與移栽愈傷組織分化叢芽在B培養基上生根培養1-2周后，取出小 苗在自來水下洗凈根部的培養基，然后栽植到滅菌的介質中〔土 蛭石泥炭土(質量比) =1:1: 1〕，遮蔭散射光照射。
本發明的技術效果表現在無需添加谷氨酰胺、水解酪蛋白等有機成分，可在一種 培養基上完成愈傷組織誘導和植株再生全過程，還可加速芽的分化和生根。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明實施例大型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基，包括MS培養基和愈傷組織誘 導與植株再生高效培養基，MS培養基按照以下原料制成a)大量元素(mg/L)硝酸鉀(KN03) 1900、硝酸銨(NH4N03) 1650、磷酸二氫鉀 (KH2P04) 170、硫酸鎂(MgS04. 7H20)370、氯化鈣(CaC12. 2H20) 440b)微量元素(mg/L)碘化鉀(KI)0.83、硼酸(H3B03)6. 2、硫酸錳 (MnS04. 4H20) 22. 3、硫酸鋅(ZnS04. 7 H20) 8. 6、鉬酸鈉(Na2Mo04. 2 H20) 0. 25、硫酸銅 (CuS04. 5 H20)0. 025、氯化鈷(CoC12)0. 025c)有機成分(mg/L)肌醇100、甘氨酸2、鹽酸硫胺素(VB1)0. 1、鹽酸吡哆醇 (VB6) 0. 5、煙酸(VB5 或 VPP) 0. 5d)鐵鹽(mg/L)乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA)37. 3、硫酸亞鐵 (FeS024. 7H20) 27. 8愈傷組織誘導與植株再生高效培養基配方，按照以下成分組成a)主培養基MS 基本培養基+KT 2mg/L+IBA 0. 4mg/L+2，4，5_T 2mg/Lb)A培養基(快速分化培養基):MS基本培養基+KT 2. 5mg/L+IAA0. 5mg/Lc) B培養基(快速生根培養基):MS基本培養基+IAA 0. 25mg/L+IBA 0. 4mg/LMS培 養基要求PH 5. 6-6.0，蔗糖30%，瓊脂7g/L。大型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基的制備方法，包括以下步驟a)母液的配置母液1 (50 X大量元素)500ml 母液稱取41. 25g NH4N03、47. 5g KN03、4. 25g KH2P04、9. 25g MgS04 7H20母液2(100 X) 250ml 母液稱取:llg CaC12 2H20母液3 (棕色瓶)250ml 母液(100 X) 695mg FeS04 7H20、932. 5mgNa2-EDTA分別溶解，每個試劑溶于120ml水，用電爐或微波爐加熱，再混合定容，母液 4(100X微量元素)，250ml 母液稱取 557. 5mg MnS04 4H20、215mg ZnS04 7H20、205mgH3B04、20. 75mg KI、6. 25mg Na2Mo04 2H20、0. 625mg CuS04 5H20、0. 625mgCoC12 6H20母液5 (1000 X) 100ml 母液稱取10mg硫胺酸 Bl、50mg 吡哆醇 B6、50mg 煙酸、200mg
甘氨酸b)激素的配置lmg/ml 2，4，5_T 稱取10mg 2，4，5-T于干燥的容器內，加入無水乙醇至完全溶 解，用蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml NAA或IAA 稱取10mg NAA或IAA于干燥的容器內，逐滴加入無水乙醇，至 完全溶解。用蒸餾水定容至10ml ；
lmg/ml KT 稱取10mg KT于干燥的容器內，逐滴加入1M的HC1.至完全溶解，用蒸 餾水定容至10ml ；c) NaOH、HC1 溶液的配置配置100ml 5N NaOH、4N HC1用于調節PH值20g NaOH定容至100ml的蒸餾水中， 34. 48ml HC1定容至100ml的蒸餾水中；d) MS溶液的混合配制MS培養基時，每1000ml培養基取20ml母液1、10ml母液2、10ml母液3、10ml 母液4、lml母液5，分別依次加入到800ml蒸餾水中，混勻后加入30g蔗糖定溶至1000ml， 用 5N NaOH 調 PH 到 5. 6-6. 0 ；e)添加激素主培養基每1000ml MS 培養基中加入 2ml KT (lmg/ml)+0. 4ml IBA (lmg/ml)+2ml 2，4，5-T(lmg/ml)A 培養基每 1000ml MS 培養基中加入 2. 5ml KT (lmg/ml)+0. 5mlIAA (lmg/ml)B 培養基每 1000ml MS 培養基中加入 0. 4ml IBA (lmg/ml)+0. 25ml IAA (lmg/ml)瓊脂粉為0. 8%，即每1000ml MS培養基中8g瓊脂粉，加熱溶解后分裝至50ml三 角瓶內；f)高壓滅菌121度下滅菌15分鐘，放置1-2天后備用；g)外植體消毒將竹種子洗凈泡脹12小時，在超凈臺中用70%乙醇浸泡30s，無 菌水沖洗三次，0. 升汞浸泡30min，期間不斷震蕩，再用無菌水沖洗5_6次；h)愈傷組織誘導取胚接種于愈傷組織培養基中，暗培養7-10天后轉移至光照 下。12h. cf1光照條件下進行，光照強度20001x，溫度25-26°C。愈傷組織誘導同時可發生芽 分化和植株再生。為加速芽分化，可將有芽點的愈傷轉入快速分化培養基(A培養基)。該 培養基也可以誘導無芽點的胚性愈傷組織分化成苗；i)生根、壯苗與移栽愈傷組織分化叢芽在B培養基上生根培養1-2周后，取出小 苗在自來水下洗凈根部的培養基，然后栽植到滅菌的介質中(土 蛭石泥炭土(質量比) =1:1: 1)，遮蔭散射光照射。培養基組成以MS為基本培養基，添加特定的3種激素，無需添加谷氨酰胺、水解酪 蛋白等有機成分，可在一種培養基上完成愈傷組織誘導和植株再生全過程，愈傷組織的誘 導率可達90%，從愈傷組織誘導至再生苗的形成僅需40-60天。提供了 A、B兩種附加培養 基可加速芽的分化和生根，可以適用于大型紙漿用竹的體細胞無性系變異、品種改良及利 用基因工程技術進行外源基因的遺傳轉化等。
權利要求
大型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基，包括MS培養基和愈傷組織誘導與植株再生高效培養基，其特征在于MS培養基按照以下原料制成a)大量元素(mg/L)硝酸鉀(KN03)1900、硝酸銨(NH4NO3)1650、磷酸二氫鉀(KH2PO4)170、硫酸鎂(MgSO4.7H2O)370、氯化鈣(CaCl2.2H2O)440b)微量元素(mg/L)碘化鉀(KI)0.83、硼酸(H3BO3)6.2、硫酸錳(MnSO4.4H2O)22.3、硫酸鋅(ZnSO4.7 H2O)8.6、鉬酸鈉(Na2MoO4.2 H2O)0.25、硫酸銅(CuSO4.5 H2O)0.025、氯化鈷(CoCl2)0.025c)有機成分(mg/L)肌醇100、甘氨酸2、鹽酸硫胺素(VB1)0.1、鹽酸吡哆醇(VB6)0.5、煙酸(VB5或VPP)0.5d)鐵鹽(mg/L)乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA)37.3、硫酸亞鐵(FeSO24.7H2O)27.8。
2.根據權利要求1所述的愈傷組織誘導與植株再生高效培養基配方，其特征在于按照 以下成分組成a)主培養基MS基本培養基+KT 2mg/L+IBA 0. 4mg/L+2，4，5_T 2mg/Lb)A培養基(快速分化培養基)MS基本培養基+KT2. 5mg/L+IAA0. 5mg/Lc)B培養基(快速生根培養基)MS基本培養基+IAA0. 25mg/L+IBA 0. 4mg/L。
3.根據權利要求1所述的MS培養基，其特征在于MS培養基要求PH5. 6-6.0，蔗糖 30%，瓊脂 7g/L。
4.大型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基的制備方法，其特征在于包括以下 步驟a)母液的配置母液1(50X大量元素)500ml 母液稱取41. 25g NH4N03、47. 5g KN03、4. 25g KH2P04、9. 25g MgS04 7H20母液 2(100 X) 250ml 母液稱取llg CaC12 2H20母液 3 (棕色瓶)250ml 母液(100 X) 695mg FeS04 7H20、932. 5mgNa2-EDTA分別溶解，每個試劑溶于120ml水，用電爐或微波爐加熱，再混合定容， 母液4(100 X微量元素)，250ml 母液稱取 557. 5mg MnS04 4H20、215mg ZnS04 7H20、205mgH3B04、20. 75mg KI、 6. 25mg Na2Mo04 2H20、0. 625mg CuS04 5H20、0. 625mgCoC12 6H20母液5 (1000 X) 100ml母液稱取10mg硫胺酸Bl、50mg吡哆醇B6、50mg煙酸、200mg甘氨酸b)激素的配置lmg/ml 2，4，5-T 稱取10mg 2，4，5-T于干燥的容器內，加入無水乙醇至完全溶解，用 蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml NAA或IAA 稱取10mg NAA或IAA于干燥的容器內，逐滴加入無水乙醇，至完全 溶解。用蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml KT:稱取10mg KT于干燥的容器內，逐滴加入1M的HC1.至完全溶解，用蒸餾水 定容至10ml ；c)NaOH、HCl溶液的配置配置100ml 5N NaOH、4N HC1用于調節PH值20g NaOH定容至100ml的蒸餾水中，` 34. 48ml HC1定容至100ml的蒸餾水中；d)MS溶液的混合配制MS培養基時，每1000ml培養基取20ml母液l、10ml母液2、10ml母液3、10ml母 液4、lml母液5。分別依次加入到800ml蒸餾水中，混勻后加入30g蔗糖定溶至1000ml，用 5N NaOH 調 PH 到 5. 6-6. 0 ；e)添加激素主培養基每 1000ml MS 培養基中加入 2ml KT (lmg/ml)+0. 4ml IBA (lmg/ml)+2ml 2， 4，5-T(lmg/ml)A 培養基每 1000ml MS 培養基中加入 2. 5ml KT (lmg/ml)+0. 5mlIAA (lmg/ml) B 培養基每 1000ml MS 培養基中加入 0. 4ml IBA (lmg/ml)+0. 25mlIAA (lmg/ml) 瓊脂粉為0. 8%，即每1000ml MS培養基中8g瓊脂粉，加熱溶解后分裝至50ml三角瓶內；f)高壓滅菌121度下滅菌15分鐘，放置1-2天后備用；g)外植體消毒將竹種子洗凈泡脹12小時，在超凈臺中用70%乙醇浸泡30s，無菌水 沖洗三次，0. 升汞浸泡30min，期間不斷震蕩，再用無菌水沖洗5_6次；h)愈傷組織誘導取胚接種于愈傷組織培養基中，暗培養7-10天后轉移至光照下。 12h. cf1光照條件下進行，光照強度20001x，溫度25-26°C。愈傷組織誘導同時可發生芽分 化和植株再生。為加速芽分化，可將有芽點的愈傷轉入快速分化培養基(A培養基)。該培 養基也可以誘導無芽點的胚性愈傷組織分化成苗；i)生根、壯苗與移栽愈傷組織分化叢芽在B培養基上生根培養1-2周后，取出小苗在 自來水下洗凈根部的培養基，然后栽植到滅菌的介質中〔土 蛭石泥炭土(質量比)= 1:1: 1〕，遮蔭散射光照射。
全文摘要
本發明涉及一種適用于慈竹和綿竹等大型叢生竹的培養基和培養方法，具體為大型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基及其培養方法。大型叢生竹愈傷組織誘導與植株再生高效培養基，包括MS培養基和愈傷組織誘導與植株再生高效培養基，其特征在于MS培養基按照以下原料制成a)大量元素硝酸鉀、硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣；b)微量元素碘化鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷；c)有機成分肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸；d)鐵鹽乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵。
文檔編號A01H4/00GK101849504SQ200910216388
公開日2010年10月6日 申請日期2009年11月27日 優先權日2009年11月27日
發明者盧學琴, 周建英, 曹穎, 段寧, 胡尚連, 陳珂 申請人:胡尚連