專利名稱：：利用濃縮椰子水提高文心蘭原球莖增殖及分化的方法
技術領域：
：本發明涉及一種文心蘭原球莖增殖及分化方法，具體涉及一種通過添加濃縮椰子水可明顯地提高文心蘭原球莖增殖及分化方法。
背景技術：
：蘭花是一種以香著稱的花卉，以其特有的葉、花、香獨具四清(氣清、色清、神清、韻清)給人以極高潔、清雅的優美形象，古今名人對它品價極高，被喻為花中君子。蘭花種子發芽率低，時間長，而且不整齊，使蘭花的培育生產不能更好地滿足市場的需求。目前，蘭花的種苗生產主要利用組織培養的技術方法，可有效地提高蘭花良種的快速繁殖系數。采用組織培養的方法，可周年規模化生產性狀整齊_致的種苗供生產上應用，但在組織培養過程中如何提高種苗的繁殖速率一直是研究人員和生產企業關心的問題。組織培養中常用的有機添加物如椰子水、香蕉和馬鈴薯等是一類含有氨基酸、激素和酶等有機成分較為復雜的天然復合物。研究證明，它們對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用。在蘭花的快速組織培養中曾多人嘗試著通過添加不同的有機物以達到此目的，劉曉燕等人通過添加不同的有機物如椰乳、香蕉、馬鈴薯、蘋果等對蝴蝶蘭原球莖增殖效果進行了研究，通過實驗比較分析發現以椰乳的增殖效果最好。陳發菊等通過活性碳和椰乳對文心蘭離體芽尖培養的影響研究也表明對文心蘭叢生芽的分化具明顯的促進作用。由此可見，椰子水可以作為完善植物組織培養再生體系的添加劑使用。由于組培中所需椰子水添加量較大，而目前，我國椰子來源僅限于海南省，產地范圍較小，且椰子果大，運輸相當不便，因而組培工廠獲取椰子水的成本較高，不利于組培中椰子水的應用，制約了文心蘭組織培養的生產途徑，而濃縮椰子水對植物組織培養過程的影響尚未見有報道。
發明內容本發明的目的是提供一種利用濃縮椰子水提高文心蘭原球莖增殖及分化的方法，通過添加濃縮椰子水的方式顯著提高文心蘭原球莖的增殖率，有效提高文心蘭組培再生體系。本發明所采用的技術方案—種利用濃縮椰子水提高文心蘭原球莖增殖及分化的方法，由以下步驟組成1、濃縮椰子水的制備將椰子水置于旋轉蒸發儀上濃縮1015倍至椰子水的糖濃度為4060%得到濃縮椰子水，備用；旋轉蒸發儀溫度控制在508(TC，真空度-0.070.08MPa，轉速為3040轉/min。2、外植體材料的選擇及原球莖的誘導取文心蘭植株莖尖洗凈后，留長約23cm的幼芽，經無菌水沖洗、酒精浸泡后，加入0.15%HgCl2溶液進行滅菌，然后用無菌水沖洗，濾紙吸干，剝取莖尖接種到誘導培養基3上進行誘導培養，培養溫度2428°C，ra5.8，光照度150020001x，光照12小時/天。15天后莖尖開始膨脹，23天后在莖尖基部出現了類似愈傷組織樣的乳狀突起，一個月后可陸續產生原球莖。所述誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，并添加6-BA4mg/L、NAA0.5mg/L、30g/L蔗糖、5.Og/L瓊脂粉、lg/L活性炭和1%體積的濃縮椰子水。3、原球莖增殖培養將誘導產生的原球莖轉接到增殖培養基上進行增殖培養，培養溫度242『C，光照度150020001x下進行培養，光照12小時/天。所述增殖培養基是以MS培養基為基礎培養基，并添加6-BA2mg/L、NAA0.5mg/L、30g/L蔗糖、5.Og/L瓊脂粉、1.Og/L活性炭和0.54%體積的濃縮椰子水。4、分化培養從繼代的原球莖中選取生長良好、翠綠色、結構較為致密的原球莖轉入分化培養基上進行分化培養。所述分化培養基是以1/2MS培養基為基礎培養基，并添加6-BA0.5mg/L、+308/1蔗糖、5.(^/1瓊脂粉、1.(^/1活性炭和1%體積的濃縮椰子水。原球莖在增大的同時，也會發生少量增殖，4周左右原球莖開始分化出芽。5、生根壯苗將分化出的叢生芽切割成單個芽，接種在生根壯苗培養基上培養至成苗。所述生根壯苗培養基是以1/2MS培養基為基礎培養基，并添加IBA0.5mg/L、30g/L蔗糖、5.Og/L瓊脂粉和1.0g/L活性炭。發明人在增殖培養、分化培養階段通過將濃縮椰子水添加至培養基中進行對比試驗，實驗結果見表1。在增殖培養、分化培養階段利用濃縮前后的椰子水添加至培養基中進行對比試驗，實驗結果見表2。表1濃縮椰子水對原球莖增殖及分化的影響培養基中椰子水添加量原球莖增殖倍數分化率％生長速度原球莖生長性狀描述00.820+青色偏暗褐0.51.130.10++青色、少許偏黃11.360.83+++嫩綠色、圓形、致密21.270.30+++嫩綠色、圓形、致密31.500.21+++嫩綠色、圓形41.410.23+++嫩綠色、圓形注生長速度+號表示生長情況，+越多生長情況越好(椰子水濃縮前糖濃度為5%，濃縮倍數為10)表2椰子水、濃縮椰子水對原球莖增殖及分化的比較培養基中椰子水添加量原球莖增殖倍數分化率%<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表1可見，在培養基中的添加14%體積的濃縮椰子水比不添加或少量添加，文心蘭原球莖的增殖倍數有明顯提高，生長情況良好，原球莖嫩綠色，圓形，結構致密。芽的分化率在添加1%濃縮椰子水時變化明顯，達0.83%，極顯著高于其他處理。由表2可見，濃縮椰子水綜合表現效果好。本發明利用濃縮椰子水作為有機添加物可顯著提高文心蘭原球莖組織的增殖率，在提高原球莖組織增殖率的基礎上，有效地提高組培苗繁殖率，為工廠化生產文心蘭提供一條有效途徑，實用性強，操作簡單，推廣性好。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例一1、取材同色文心蘭(0ncidiumconcolor)2、外植體的消毒晴朗天氣早晨取文心蘭莖尖包好，迅速帶回實驗室用自來水沖洗，留長約2-3cm的幼芽，在超凈工作臺上先用無菌水沖洗2遍，再用70%的酒精浸泡1分鐘，倒去酒精加入0.15%HgCl2溶液滅菌8分鐘，無菌水沖洗5次后，用滅過菌的濾紙吸干，剝取莖尖接種到誘導培養基上進行誘導培養，誘導培養基為MS+6-BA4mg/L+NAA0.5mg/L+30g/L蔗糖+5.Og/L瓊脂粉+lg/L活性炭+l^體積椰子水；培養條件為溫度26°C，PH5.8，光照度150020001x，光照12小時/天。待15天后莖尖開始膨脹，23天后在莖尖基部出現了類似愈傷組織樣的乳狀突起，一個月后可陸續產生原球莖。3、原球莖的增殖將誘導產生的原球莖進行增殖擴繁，將其轉接到添加了濃縮椰子水的增殖培養基上進行增殖培養，增殖培養基為MS+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+30g/L蔗糖+5.Og/L瓊脂粉+1.Og/L活性炭+1%體積濃縮椰子水，在光照下進行培養。4、分化培養從繼代的原球莖中選取生長良好、翠綠色、結構較為致密的原球莖轉入分化培養基上分化培養。所述分化培養基為1/2MS+6-BA0.5mg/L++30g/L蔗糖+5.Og/L瓊脂粉+1.Og/L活性炭+1%體積濃縮椰子水。原球莖在增大的同時，也會發生少量增殖，4周左右原球莖開始分化出芽。5、壯苗生根將叢生芽切割成單個芽，接種在生根壯苗培養基上，該階段采用的培養基為1/2MS+IBA0.5mg/L+30g/L蔗糖+5.Og/L瓊脂粉+1.Og/L活性炭，生長狀況良好。權利要求一種利用濃縮椰子水提高文心蘭原球莖增殖及分化的方法，其特征在于，具體步驟如下1)、濃縮椰子水的制備將椰子水置于旋轉蒸發儀上濃縮10～15倍至椰子水的糖濃度為40～60％得到濃縮椰子水，備用；2)、外植體材料的選擇及原球莖的誘導取文心蘭植株莖尖洗凈后，留長約2～3cm的幼芽，經無菌水沖洗、酒精浸泡后，加入0.15％HgCl2溶液進行滅菌，然后用無菌水沖洗，濾紙吸干，剝取莖尖接種到誘導培養基上進行誘導培養，培養溫度24～28℃，PH5.8，光照度1500～2000lx，光照12小時/天；所述誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，并添加6-BA4mg/L、NAA0.5mg/L、30g/L蔗糖、5.0g/L瓊脂粉、1g/L活性炭和1％體積的濃縮椰子水；3)、原球莖增殖培養將誘導產生的原球莖轉接到增殖培養基上進行增殖培養，培養溫度24～28℃，光照度1500～2000lx下進行培養，光照12小時/天；所述增殖培養基是以MS培養基為基礎培養基，并添加6-BA2mg/L、NAA0.5mg/L、30g/L蔗糖、5.0g/L瓊脂粉、1.0g/L活性炭和0.5～4％體積的濃縮椰子水；4)、分化培養從繼代的原球莖中選取生長良好、翠綠色、結構較為致密的原球莖轉入分化培養基上進行分化培養；所述分化培養基是以1/2MS培養基為基礎培養基，并添加6-BA0.5mg/L、+30g/L蔗糖、5.0g/L瓊脂粉、1.0g/L活性炭和1％體積的濃縮椰子水；5)、生根壯苗將分化出的叢生芽切割成單個芽，接種在生根壯苗培養基上培養至成苗；所述生根壯苗培養基是以1/2MS培養基為基礎培養基，并添加IBA0.5mg/L、30g/L蔗糖、5.0g/L瓊脂粉和1.0g/L活性炭。2.根據權利要求1所述的利用濃縮椰子水提高文心蘭原球莖增殖及分化的方法，其特征在于所述在椰子水濃縮過程中旋轉蒸發儀溫度控制在508(TC，真空度-0.070.08MPa，轉速為3040轉/min。全文摘要本發明公開了一種利用濃縮椰子水提高文心蘭原球莖增殖及分化的方法，是將椰子水置于旋轉蒸發儀上進行濃縮得到濃縮椰子水，備用；取文心蘭植株莖尖經滅菌后接種到添加濃縮椰子水的誘導培養基上進行誘導培養產生的原球莖，將原球莖轉接到增殖培養基上進行增殖培養，再轉入分化培養基上進行分化培養產生叢生芽，將叢生芽接種在生根壯苗培養基上培養至成苗。本發明利用濃縮椰子水作為有機添加物可顯著提高文心蘭原球莖組織的增殖率，在提高原球莖組織增殖率的基礎上，有效地提高組培苗繁殖率，為工廠化生產文心蘭提供一條有效途徑，實用性強，操作簡單，推廣性好。文檔編號A01H4/00GK101785431SQ201010146830公開日2010年7月28日申請日期2010年3月12日優先權日2010年3月12日發明者周煥起,李杰,范海闊,覃偉權,馬子龍,黃麗云申請人:中國熱帶農業科學院椰子研究所