專利名稱：：菊芋組織培養的方法及其專用培養基的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種植物組織培養領域，特別涉及一種菊芋組織培養的方法其專用培養基。
背景技術：
：菊芋(HelianthustuberosusL.)又名洋姜，鬼子姜，為菊科向日葵屬多年生植物。葉片基部下延在兩側成翼為不完全葉，對生、輪生或互生于直立莖上；莖稈高度一般2m左右；管狀花黃色，頭狀花序較小；果實為瘦果，一般不能正常成熟，沒有發芽能力，不能種子繁殖；塊狀地下莖，其產量受地理位置、栽培品種和生長環境等方面因素影響，多在1250-5000公斤/畝范圍。菊芋原產北美，我國各地普遍栽培。耐旱、耐寒、耐各種病害、抗風沙、以塊莖繁殖，即使在不施肥的廢墟、撂荒、鹽堿等地塊都能生長，適應性很強。菊芋是一種多用途原料植物，塊莖中含有豐富的菊糖，可供食用。菊糖轉為果糖后，不僅甜度高(是蔗糖的1.8倍)，而且其在體內代謝不受胰島素影響，進入血液速度慢，高血壓、肥胖病、糖尿病患者均可食用，對人類的飲食健康有著非常重要的作用，是制糖和生產高果糖漿的原料。菊芋也能提制酒精和白酒，果糖發酵后可用來生產乙醇，每升塊莖汁液可以獲得每升大約IOOg乙醇，每公頃每年生產的塊莖可以轉化成4500L乙醇和碳氫燃料，被稱為“綠色石油”，是很好的代用燃料。此外，新鮮的莖、葉可做飼料；莖桿中的纖維也可供造紙用等。因此，菊芋是一種用途廣泛、極具開發潛力的植物。
發明內容本發明的目的在于提供一種菊芋的叢生芽分化培養基。本發明提供的菊芋的叢生芽分化培養基是在MS基本培養液中添加如下物質得到的固體培養基IAA、6-BA、ZT、碳源和凝膠劑；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；所述叢生芽分化培養基中IAA的終濃度是0.05-0.15mg/L、6_BA終濃度是0.1-2.Omg/L、ZT的終濃度是0.3-0.5mg/L。表1.MS基本培養液的溶質_大量元素_培養基中濃度(g·!/1)CaCl2.2H200.44<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述凝膠劑可以是瓊脂粉、卡拉膠或Gelrite等組織培養常用固化劑，優選的是瓊脂；瓊脂以能達到的培養基硬度為基礎，可適當調整用量，本發明中所有培養基中的瓊脂均可以是6g/L。上述碳源可以是20_40g/L的葡萄糖或蔗糖，優選為30g/L蔗糖。進一步，上述叢生芽分化培養基中IAA、6_BA和ZT的終濃度分別是如下1)_4)中任一種1)IAA為0.05-0.15mg/L、6_BA為0.5-1.5mg/L和ZT為0.3-0.5mg/L；2)IAA為0.lmg/L、6-BA為0.5mg/L和ZT為0.4mg/L；3)IAA為0.lmg/L、6-BA為1.Omg/L和ZT為0.4mg/L；4)IAA為0.lmg/L、6-BA為1.5mg/L和ZT為0.4mg/L。本發明的又一目的是為了提供一種生產菊芋再生苗的方法。本發明提供的生產菊芋再生苗的方法，包括以下步驟a)將菊芋的帶葉莖段置于上述的叢生芽分化培養基中培養，得到苗；b)將步驟a)得到的苗轉接到生根培養基中進行生根培養，得到菊芋再生苗。所述生根培養基是在MS基本培養液中，添加ΙΑΑ、NAA、6_BA、ZT、蔗糖和瓊脂得到的固體培養基；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；所述生根培養基中IAA的終濃度是0.1-0.3mg/L,NAA的終濃度為0.5-1.5mg/L，6-BA的終濃度為0.05-0.15mg/L,ZT的終濃度為0.05-0.15mg/L以及蔗糖的終濃度為20-40g/Lo進一步，上述生根培養基中ΙΑΑ、NAA.6-BA和ZT的終濃度分別是如下1)_3)中任一種1)IAA0.2mg/L、NAA0.5mg/L、6_BA0.lmg/L和ZTO.lmg/L；2)IAA0.2mg/L、NAA1.0mg/L、6_BA0.lmg/L和ZTO.lmg/L；3)IAA0.2mg/L、NAA1.5mg/L、6_BA0.lmg/L和ZTO.lmg/L。上述菊芋的帶葉莖段是由菊芋頂芽置于頂芽培養基中培養得到的無菌小苗經剪切得到的。所述頂芽培養基是在MS基本培養液中，添加IAA、6_BA、蔗糖和瓊脂得到的固體培養基；所述頂芽培養基中IAA的終濃度為0.05-0.15mg/L,6-BA的終濃度為0.05-0.lmg/L以及蔗糖的終濃度為20-40g/L。進一步，上述頂芽培養基中IAA和6-BA終濃度分別是如下1)_3)中任一種1)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.lmg/L；2)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.5mg/L；3)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為1.Omg/L。上述生產菊芋再生苗的方法中的步驟a)與步驟b)之間還有一繼代培養的步驟；所述繼代培養的步驟是將所述步驟a)得到的苗轉接在繼代培養基上擴繁得到無根苗的步驟；所述繼代培養基為上述的叢生芽分化培養基。上述菊芋頂芽可以是經過預處理的，所述預處理是將菊芋頂芽用70%的乙醇消毒后，再用0.1%的HgCl2進行消毒，然后用無菌水沖洗至少一次。本發明的方法是利用菊芋的頂芽作為外植體建立組織培養體系，最終通過誘導叢生芽的分化建立穩定高效的組織培養體系。該體系可用于菊芋的快速繁殖，也可以用于外源基因的快速遺傳轉化、還可用于分化率遺傳研究、組織培養的材料選育等方面。采用本發明提供的菊芋組織培養的方法，叢生芽的分化率可達到100%，每個芽的年增殖系數理論上達1.6XIO7以上，生根率可達95%，移栽成活率可達95%。圖1為菊芋頂芽無菌苗。圖2為菊芋誘導分化得到的叢生芽。圖3為菊芋再生苗的生根情況。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、菊芋再生苗的獲得及其觀察分析一、帶葉莖段的獲得1)外植體的獲得選生長健壯的菊芋(從北京市石景山蘋果園農貿市場購買)塊莖作材料，在28°C，5000Lx、14h/D光照培養箱中萌發培養10天，取頂芽作外植體，建立無菌體系，提供誘導不定芽的材料。2)外植體的預處理取上述步驟1)中健康飽滿的菊芋頂芽，用70%的乙醇表面消毒1分鐘，再用0.的升汞消毒10分鐘，滅菌蒸餾水洗三次，每次10分鐘。將預處理好的菊芋頂芽外植體備用。3)得到無菌小苗將上述步驟2)中處理好的菊芋頂芽外植體接種到頂芽培養基中培養，得到無菌小苗。上述頂芽培養基是在MS基本培養液中添加IAA、6_BA、蔗糖和瓊脂得到的培養基。其中蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為6g/L，MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示，該培養基的PH值為5.8-6.0；IAA和6-BA的終濃度設置為以下Tl、T2、T3三組Tl=IAA的終濃度為0.lmg/L，6-BA的終濃度為0.lmg/L；T2IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.5mg/L；T3=IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為1.Omg/L。培養基的滅菌均采用121°C滅菌20分鐘高壓濕熱滅菌。頂芽外植體培養的條件為光照培養箱中，溫度為25°C士2，光照時間為12小時，光照強度為90μMHT2s-1。4)統計觀察實驗重復3次，統計觀察上述步驟3)中三組頂芽培養基的培養效果。接種在頂芽培養基中的菊芋頂芽在光照培養箱中培養23周后大部分都能萌發長出幼葉，實驗結果見下表2。從表2可以看出，萌發率最高且生長最好的是Τ3培養基(IAA的終濃度為0.Img/L，6-BA的終濃度為1.Omg/L)，培養1.5個月后，頂芽生長旺盛，苗高達2.Ocm-4.Ocm0其中T3培養基培養1個月的照片如圖1所示。表2.頂芽在不同頂芽培養基中的萌發情況統計(平均值士標準差)—培養基編號丨TlIΤ2T3“TT-TT外植體塊數909090接禾中3周----萌發塊數__83__84__87_』萌發率(％)一92.293.396.7.溫』ijF賊難胃(cm)2.9士0.83.1±1.23.6±1.3備注每組實驗重復3次，每次10瓶，每瓶3個外植體。二、叢生芽的獲得1)帶葉莖段的獲得采用上述步驟一的T3培養基中培養得到無菌小苗剪成5IOmm長短的帶葉莖段備用。2)誘導叢生芽分化將上述步驟1)中得到的帶葉莖段接種到叢生芽分化培養基中培養，得到叢生芽。上述叢生芽分化培養基是在MS基本培養液中添加如下物質得到的培養基IAA、6-BA、ZT、碳源和凝膠劑；其中蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為6g/L，該培養基的pH值為5.8-6.0，MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；將叢生芽分化培養基中IAA、6_BA和ZT的終濃度設置為B1-B6六組BlIAA為Omg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.4mg/L；B2JAA為0.lmg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.4mg/L；B3JAA為0.lmg/L,6-BA為0.5mg/L,ZT為0.4mg/L；B4JAA為0.lmg/L,6-BA為1.Omg/L,ZT為0.4mg/L；B5:IAA為0.lmg/L,6-BA為1.5mg/L,ZT為0.4mg/L；B6:IAA為0.lmg/L,6-BA為2.Omg/L,ZT為0.4mg/L。培養基的滅菌均采用121°C滅菌20分鐘高壓濕熱滅菌。誘導叢生芽的培養條件為光照培養箱中，溫度為25°C士2，光照時間為14小時，光照強度為100μMπΓΥ1。3)統計觀察實驗重復3次，統計觀察上述Β1-Β6各組叢生芽分化培養基誘導分化叢生芽的效果。實驗結果見下表3。從表3可以看出，在光照培養箱中培養4周后，高細胞分裂素、低生長素Β3-Β5培養基中分化較好，以Β4最好，可從莖段葉腋處和基部長出腋芽和不定芽，細胞分裂素過高將會抑制不定芽的分化。其中Β3培養基中培養4周的照片如圖2所示。表3、不同叢生芽分化培養基的叢生芽誘導情況(平均值士標準差)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>備注每組實驗重復3次，每次10瓶，每瓶接5個莖段。三、繼代培養得到無根苗在得到步驟二中的從生芽后進一步進行繼代培養。經過復數次的繼代培養，可得到所需數量的無根苗。繼代培養的次數可根據所需無根苗的數量和繼代培養的增殖系數而定。以Β1-Β6各自對應的叢生芽分化培養基作為繼代培養基，分別剪取各培養基中長出的所有小芽(包括腋芽)，分別剪切成帶葉莖段，并將較高的小芽切成長約1020mm帶葉莖段，按形態學向上的原則，將莖段的下端插入到各自的繼代培養基上培養(培養條件與步驟二中的一致)。培養至1個月，每個培養物從葉腋處和基部長出4-7個腋芽和不定芽，其中B3-B5培養基中分化最好。按此方法每個月繼代培養，分化頻率為100%，每個芽的年增殖系數理論上為1.6XIO7以上。四、再生苗的獲得1)誘導生根選取上述步驟三中得到的生長健壯、高度為1.5-3.Ocm的無根苗轉接到生根培養基中進行生根培養，得到菊芋再生苗。上述生根培養基是在MS基本培養液中，添加ΙΑΑ、NAA、6_BA、ZT、蔗糖和瓊脂得到的培養基；其中蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為6g/L，pH值為5.8-6.0，MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；其中ΙΑΑ、NAA.6-BA和ZT的終濃度設置為R1-R4四組RlJAA為0.2mg/L,NAA為0.lmg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.lmg/L；R2JAA為0.2mg/L,NAA為0.5mg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.lmg/L；R3JAA為0.2mg/L,NAA為1.Omg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.lmg/L；R4JAA為0.2mg/L,NAA為1.5mg/L,6-BA為0.lmg/L,ZT為0.lmg/L。培養基的滅菌均采用121°C滅菌20分鐘高壓濕熱滅菌。生根培養的培養條件置于光照培養箱中，在溫度為25V士2，光照時間為10小時，光照強度為110μMHT2iT1。2)統計觀察實驗重復3次，統計觀察上述R1-R4各組生根培養基誘導生根的情況。無根苗在光照培養箱中培養3周統計觀察，實驗結果見下表4。從表4可以看出，高生長素和低細胞分裂素的R2R4培養基都有較好效果。表4、不同生根培養基誘導生根的情況(平均值士標準差)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>備注每組實驗重復3次，每次10瓶，每瓶接5個莖段。3)煉苗移栽將步驟2)中獲得的再生苗在培養瓶中再培養1周后，使根和苗生長更加粗壯(R3培養基的照片如圖3所示)，即可出瓶煉苗。用自來水洗去再生苗的培養基。然后，將再生苗移栽至裝有按11混合的草炭土和蛭石的塑料小盆中，將其轉移光照培養箱中，在溫度為25V士2，光照時間為10小時，光照強度為ΙΙΟμΜπΓ、—1條件下培養，并統計成活率。實驗重復3次，統計觀察。實驗結果叢表5中可以看出，成活率為95%以上。表5、煉苗移栽的成活率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權利要求一種菊芋的叢生芽分化培養基，是在MS基本培養液中添加如下物質得到的固體培養基IAA、6-BA、ZT、碳源和凝膠劑；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；所述叢生芽分化培養基中IAA的終濃度是0.05-0.15mg/L、6-BA終濃度是0.1-2.0mg/L、ZT的終濃度是0.3-0.5mg/L。2.如權利要求1所述的培養基，其特征在于所述凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或GelriteJt選是瓊脂，所述瓊脂的終濃度為6g/L；所述碳源是終濃度為20-40g/L的葡萄糖或蔗糖，優選是終濃度為30g/L的蔗糖。3.如權利要求2所述的培養基，其特征在于所述菊芋的叢生芽分化培養基中IAA、6-BA和ZT的終濃度分別是如下1)_4)中任一種1)IAA為0.05-0.15mg/L、6-BA為0.5-1.5mg/L和ZT為0.3-0.5mg/L；2)IAA為0.lmg/L、6-BA為0.5mg/L和ZT為0.4mg/L；3)IAA為0.lmg/L、6-BA為1.Omg/L和ZT為0.4mg/L；4)IAA為0.lmg/L、6-BA為1.5mg/L和ZT為0.4mg/L。4.一種生產菊芋再生苗的方法，包括以下步驟a)將菊芋的帶葉莖段置于權利要求1-3中任一所述的菊芋的叢生芽分化培養基中培養，得到苗；b)將步驟a)得到的苗轉接到生根培養基中進行生根培養，得到菊芋再生苗。5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述生根培養基是在MS基本培養液中，添加IAA、NAA、6-BA、ZT、蔗糖和瓊脂得到的固體培養基；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示；所述生根培養基中IAA的終濃度是0.1-0.3mg/L,NAA的終濃度為0.5-1.5mg/L，6_BA的終濃度為0.05-0.15mg/L,ZT的終濃度為0.05-0.15mg/L以及蔗糖的終濃度為20_40g/L06.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述生根培養基中IAA、NAA.6-BA和ZT的終濃度分別是如下1)_3)中任一種1)IAA0.2mg/L、NAA0.5mg/L、6_BA0.lmg/L和ZT0.lmg/L；2)IAA0.2mg/L、NAA1.Omg/L,6-BA0.lmg/L和ZT0.lmg/L；3)IAA0.2mg/L、NAA1.5mg/L、6_BA0.lmg/L禾口ZT0.lmg/L。7.如權利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述菊芋的帶葉莖段是由菊芋頂芽置于頂芽培養基中培養得到的無菌小苗經剪切得到的。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述頂芽培養基是在MS基本培養液中，添加IAA、6-BA、蔗糖和瓊脂得到的固體培養基；所述頂芽培養基中IAA的終濃度為0.05-0.15mg/L,6-BA的終濃度為0.05-0.lmg/L以及蔗糖的終濃度為20_40g/L。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述頂芽培養基中IAA和6-BA終濃度分別是如下1)_3)中任一種1)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.lmg/L；2)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為0.5mg/L；3)IAA的終濃度為0.lmg/L,6-BA的終濃度為1.Omg/L。10.如權利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述步驟a)與步驟b)之間還有一繼代培養的步驟；所述繼代培養的步驟是將所述步驟a)得到的苗轉接在繼代培養基上擴繁得到無根苗的步驟；所述繼代培養基為權利要求1-3中任一所述的菊芋的叢生芽分化培養基。全文摘要本發明公開了一種菊芋組織培養的方法及其專用培養基。本發明提供的專用培養基是叢生芽分化培養基，具體是在MS基本培養液中添加如下物質得到的培養基IAA、6-BA、ZT、碳源和凝膠劑；所述MS基本培養液的溶劑是水，溶質如表1所示；所述叢生芽分化培養基中IAA的終濃度是0.05-0.15mg/L、6-BA終濃度是0.1-2.0mg/L、ZT的終濃度是0.3-0.5mg/L。采用本發明提供的菊芋組織培養的方法，叢生芽的分化率可達到100％，每個芽的年增殖系數理論上達1.6X107以上，生根率可達95％，移栽成活率可達95％。文檔編號A01H4/00GK101803575SQ201010160829公開日2010年8月18日申請日期2010年4月26日優先權日2010年4月26日發明者曹川申請人:曹川