專利名稱：一種應用于豬、雞養殖的制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種應用于豬、雞養殖的制劑，具體是由粘膜乳桿菌制成的制劑在促進豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉化率中的應用。
背景技術：
2006年底在全國爆發的大菱鲆藥殘事件給我們敲響了警鐘。歐盟已于2006年全面禁止抗菌藥作為飼料添加劑在動物養殖中的應用。為保證食品安全，美國等發達國家對肉類、海產品等抗菌藥殘留進行檢測。隨著中國加入世貿組織，名優產品出口被普遍看好。 但由于國內養殖不科學使用抗生素等有害藥物的現象嚴重，大大限制了產品的出口。抗菌藥替代產品是豬和雞養殖業中迫切需要的。
發明內容
本發明的目的是提供一種促進豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉化率的制劑，該制劑由粘膜乳桿菌制成。本發明的制劑的制備優選是通過下述步驟實施的，但不局限于此制備工藝，公知的能實現的制備工藝均可以采取可能含粘膜乳桿菌的樣本，然后將樣品置于滅菌厭氧瓶內，吹入氮氣同時充分混合，迅速從中取一定量的樣品加入18mL滅菌的稀釋液中，吹入氮氣同時充分混勻，在無菌操作臺內，進行10—1、10_2、10_3、ΙΟ"4, ΙΟ"5, ΙΟ"6, ΙΟ"7梯度稀釋，取 ΙΟ"5, ΙΟ"6, ΙΟ"7三個稀釋梯度，分別涂布于粘膜乳桿菌選擇性單菌落分離固體培養基上，置于厭氧罐內，厭氧37°C下培養48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴增培養基中，置于厭氧罐內，厭氧37°C下擴增培養48小時。將所得培養液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調制出干燥菌粉，然后根據《伯杰細菌鑒定手冊》、相關細菌鑒定文獻或16S rRNA序列對比分析進行粘膜乳桿菌鑒定和毒性試驗，將無毒性的粘膜乳桿菌干燥菌粉按需要比例添加輔料制成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體制劑等各種劑型，或制成獸藥和飼料添加劑，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協同作用。粘膜乳桿菌選擇性單菌落分離固體培養基優選但不局限于純化水IOOOmL,胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，三水醋酸鈉晶體5g，檬酸三銨2g，MgSO4. 7H20 0. 2g，瓊脂15g，肉浸膏 10g，葡萄糖 20g,吐溫-80 lmL，磷酸氫二鉀 2g, MnSO4. 2H20 0. 05g。調 ρΗ6· 2-6. 3，121 °C 高壓滅菌15min。粘膜乳桿菌液體擴增培養基優選但不局限于純化水lOOOmL，胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，三水醋酸鈉晶體5g，檬酸三銨2g，MgSO4. 7H20 0. 2g，肉浸膏10g，葡萄糖20g,吐溫-80 lmL，磷酸氫二鉀 2g，MnSO4. 2H20 0. 05g。調 pH6. 2-6. 3，121°C 高壓滅菌 15min。為進一步具體說明本發明，發明人利用上述方法通過粘膜乳桿菌選擇性單菌落分離固體培養基分離鑒定出了無毒性的粘膜乳桿菌，本發明所述粘膜乳桿菌并不局限于為說明本發明所述的菌株，只要無毒性的粘膜乳桿菌均是本發明所述，均在本發明的保護范圍內。
本發明所述粘膜乳桿菌優選但不限于粘膜乳桿菌DH103保藏編號CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號CGMCC3763。本發明實施說明中優選使用的粘膜乳桿菌的細菌學性質1、為說明本發明，本發明利用上述方法分離的粘膜乳桿菌分別為粘膜乳桿菌 DH103保藏編號CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號 CGMCC3763。2、菌落形態顯微鏡觀察桿菌，革蘭氏染色陽性。平板形態菌落呈乳白色、表面光滑、圓潤、凸出于培養基表面、大小l_2mm。3、生理生化鑒定明膠液化_ ；過氧化氫酶_ ；硫化氫_ ；硝酸鹽還原_ ；是否需氧厭氧性。4、糖酵解實驗鑒定葡萄糖+ ；核糖+ ；麥芽糖+ ；蔴糖+ ；葡糖酸+ ；D-木糖+ ；蜜二糖+ ；D-棉子糖+ ；D-果糖_ ；丙三醇_ ；赤蘚糖醇_ ；L-木糖-；側金盞花醇_ ；肌醇_ ；山梨醇_ ； 纖維二糖_ ；海藻糖_ ；松三糖_ ；甘露醇_ ；菊粉_。5、分離菌株進行16S rRNA基因測序，測得序列用BLAST與GenBank和RDP數據庫中的基因序列進行相似性分析，確定分離菌株均為粘膜乳桿菌。本發明所述的粘膜乳桿菌指活生物個體。本發明是以有效劑量的上述粘膜乳桿菌作為主要藥物活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規的賦形劑、調味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、 增溶劑等輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、 粉劑等劑型。本發明所述以有效劑量的上述粘膜乳桿菌作為主要藥物活性成份制成活菌制劑， 也可以是上述粘膜乳桿菌與雙歧桿菌、鏈球菌、枯草芽孢桿菌等益生菌中的一種或幾種或其他活性成份組合制成活菌制劑，以起到協同作用，提高效果。本發明所指有效劑量是指以上述粘膜乳桿菌根據上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數不能低于lX106CFU/g，一般在 1 X 109CFU/g 以上，最高可達至Ij 1 X 10"CFU/g 或 1 X 10"CFU/g 以上。本發明所指有效劑量是指以上述粘膜乳桿菌根據上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數不能低于lX106CFU/mL，一般在 1 X 109CFU/mL 以上，最高可達到 1 X 10nCFU/mL 或 1 X 10nCFU/mL 以上。由于本發明首次公開了粘膜乳桿菌作為主要活性成份制成制劑在豬、雞養殖中的應用，因此含上述粘膜乳桿菌的制劑在豬、雞養殖中的應用均屬于本發明的保護范圍。本發明所述的粘膜乳桿菌在制成任何一種劑型時，均具有促進豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉化率的作用。任何劑型，如果其組份中含有上述粘膜乳桿菌成份制備成制劑，在其包裝或說明書等標識上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有促進豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉化率的作用，則落入本發明的保護范圍之內。本發明所述的粘膜乳桿菌可以制成獸藥或飼料添加劑。將上述粘膜乳桿菌制成的獸藥或飼料添加劑應用于促進豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉化率等豬、雞養殖中，則落入本發明的保護范圍之內。
具體實施例方式制備例說明上述已經對粘膜乳桿菌制劑的制備進行說明，這里通過粘膜乳桿菌 DH103保藏編號CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號CGMCC3763粉劑為例進行具體說明，其他粘膜乳桿菌菌種制劑的制備方法本領域技術人員通過本實施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領域技術人員通過本實施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。制備方法并不局限于本發明實施例所述，公知的能夠達到制備目的的方法均可以，實施例的制備說明只是對本發明的說明，并不是對本發明保護范圍的限制。制備實施例1粘膜乳桿菌粉劑的制備1菌粉的制備和菌種的鑒定采取小豬、雞或牛等動物的糞便，然后將糞便置于滅菌厭氧瓶內，吹入氮氣同時充分混合，迅速從中取2克糞便加入ISmL滅菌的稀釋液中，吹入氮氣同時充分混勻，在無菌操作臺內，進行IO-1UO-2UO-3UO-4, ΙΟ"5, ΙΟ"6,10_7梯度稀釋，取ΙΟ"5, ΙΟ"6,10_7三個稀釋梯度， 涂布于粘膜乳桿菌選擇性單菌落分離固體培養基上，置于厭氧罐內，厭氧37°C下培養48小時，選擇長勢良好的單菌落接種到粘膜乳桿菌液體擴增培養基中，置于厭氧罐內，厭氧37°C 下擴增培養48小時。將所得培養液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調制出干燥菌粉，活菌數均為lX109CFU/g以上，然后進行菌種鑒定，經生理生化和16S rRNA序列對比分析鑒定為粘膜乳桿菌，分別為粘膜乳桿菌DH103保藏編號CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號CGMCC3763。2毒性試驗2. 1動物及分組取40只SPF級別小鼠，6 8周齡，體重15 19g，隨機分入粘膜乳桿菌DH103組、粘膜乳桿菌DH105組、粘膜乳桿菌DH106菌和未給藥組，每組10只。2. 2制備菌液將上述不同的粘膜乳桿菌菌粉分別用純化水調制為含菌數均為 1 X 109CFU/mL 的菌液。2. 3方法各粘膜乳桿菌組和未給藥組均給予相同的基礎飼料，且飼養條件均一致，各粘膜乳桿菌組每天灌服粘膜乳桿菌菌液0. 5mL，未給藥組每天灌服純化水0. 5mL，飼喂6個月，觀察體重及毒性反應。2. 4 結果各組小鼠均未出現異常情況，未發生振顫、痙攣、運動失調、姿態異常，無眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，且各粘膜乳桿菌組的體重增加顯著高于未給藥組(P<0. 05)，表明粘膜乳桿菌菌種有促進生長發育作用，說明效果良好，未見中毒反應。3制備成粉劑等劑型根據上述步驟和方法分離鑒定后，經實驗檢驗無毒性，就可將粘膜乳桿菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關輔料制成各種劑型，優選據粘膜乳桿菌菌粉的活菌數，按比例添加淀粉制成粉劑，使活菌數不低于ι χ 109CFU/g,然后裝袋。制備實施例2嗜酸乳桿菌菌粉的制備為進一步說明本發明的新穎性和創造性，在應用效果實施例中用嗜酸乳桿菌做對
5照研究。其中選用的嗜酸乳桿菌為嗜酸乳桿菌DF96106保藏編號CGMCC0313. 4。嗜酸乳桿菌菌粉的制備培養基為(培養基不限于本發明所述的，公知的培養基均可以)大豆蛋白胨(國產)5g，胰胨(Tryptone) 5g，酵母提取物5g，肉膏10g, K2HPO4 IOg,檸檬酸二銨2g，乙酸鈉 5g,葡萄糖 20g，吐溫 80 1. OmL, MgSO4 · 7H20 4. 8g，MnSO4. 4Η200· 05g，蒸餾水 1000M1,調 PH6. 2-6.4，121°C滅菌15分鐘。將嗜酸乳桿菌DF96106接種到上述培養基中，置于厭氧罐內，厭氧37°C下擴增培養96小時。將所得培養液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調制出干燥菌粉，活菌數為lX109CFU/g以上。應用效果實施例說明本發明以粘膜乳桿菌DH103保藏編號CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號CGMCC3763為代表說明粘膜乳桿菌的應用效果。應用效果實施例1 粘膜乳桿菌在豬養殖中的應用1材料與方法1. 1 材料1.1.1試驗產品粘膜乳桿菌活菌粉劑，嗜酸乳桿菌活菌粉劑，活菌數均為1 X 109CFU/g以上。1. 1.2 試驗豬選擇30日齡的斷奶健康仔豬150頭(公母各半)，隨機分為5組，每組30頭。1.2 方法1. 2. 1試驗時間為30天。1. 2. 2該試驗采取干料飼喂，試驗組每噸飼料添加試驗產品1000克，嗜酸乳桿菌組每噸飼料添加嗜酸乳桿菌活菌粉劑1000克，對照組不加試驗產品。2試驗結果試驗結束后對各組斷奶仔豬的日增重、日采食量、料重比、死淘率進行統計分析， 粘膜乳桿菌各組之間無統計學差異(P > 0. 05)，粘膜乳桿菌與嗜酸乳桿菌和對照組之間有統計學差異(P < 0. 05)，嗜酸乳桿菌與對照組之間無統計學差異(P > 0. 05)。見表1、2.表1不同處理組斷奶仔豬的生長表現
權利要求
1.一種應用于豬、雞養殖的制劑，其特征在于該制劑由粘膜乳桿菌制成。
2.按權利要求1所述應用，其特征在于促進豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉化率。
3.按權利要求1所述制劑，其特征在于包括獸藥或飼料添加劑。
4.按權利要求1所述粘膜乳桿菌，其特征在于粘膜乳桿菌指活的生物個體。
5.按權利要求1所述粘膜乳桿菌，其特征在于包括粘膜乳桿菌DH103保藏編號CGMCC 3766。
6.按權利要求1所述粘膜乳桿菌，其特征在于包括粘膜乳桿菌DH105保藏編號CGMCC 3765。
7.按權利要求1所述粘膜乳桿菌，其特征在于包括粘膜乳桿菌DH106保藏編號CGMCC 3763。
8.按權利要求1所述制劑，其特征在于固體制劑包含的總活菌數不低于IX106CFU/g， 一般在1 X 109CFU/g以上，最高可達到1 X 10nCFU/g或1 X 10nCFU/g以上；或液體制劑包含的總活菌數不能低于1 X 106CFU/mL, 一般在1 X 109CFU/mL以上，最高可達到1 X 10nCFU/mL 或 ι χ IoiiCfuAiL 以上。
全文摘要
本發明涉及一種應用于豬、雞養殖的制劑，具體是由粘膜乳桿菌制成的制劑在促進豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉化率中的應用。
文檔編號A23K1/18GK102239963SQ20101018308
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月12日 優先權日2010年5月12日
發明者崔云龍, 李洪福 申請人:青島東海藥業有限公司