一種微生態肥及其制備方法

一種微生態肥及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種微生態肥及其制備方法，屬于農用肥料【技術領域】。所述微生態肥重量份數組成為：枯草芽孢桿菌培養物10-15，黑曲霉培養物5-10，植物乳桿菌劑20-30份。所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)保藏號為CGMCC NO.9405。本發明的肥料營養豐富，有機質含量高，能夠滿足有機食品的生產需要，能夠增強作物的抗病蟲害能力；肥料中有益微生物能產生糖類物質，占土壤有機質的0.1％，與植物粘液、礦物胚體和有機膠體結合在一起，可以改善土壤團粒結構，增強土壤的物理性能和減少土壤顆粒的損失，在一定的條件下，還能參與腐殖質形成。CGMCC NO.94052014.07.02
【專利說明】—種微生態肥及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物肥加工方法，屬于農用肥料【技術領域】，特別涉及一種微生態復合肥及其制備方法。

【背景技術】
[0002]目前市場上已出現一些復合微生物菌劑，但其或者功能單一，或者其使用方法受到限制，使用后的作物增產效果還不能達到令人滿意，所以目前仍需要開發適用于多種施用途徑、具有綜合功能和良好增產效果的復合微生物菌劑或肥料。
[0003]申請號為201310743759.4的發明專利“一種微生物肥料的制備方法”，公開了一種微生物肥料的制備方法，屬于農用肥料【技術領域】，所述微生物肥料的生產方法，是將黑曲霉培養物、解磷巨大芽孢桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌按比例混合為微生物肥料。該發明的肥料通過復合微生物發酵的方法制成，能夠改善土壤的微生態環境，為農作物的生長提供有益條件。解磷巨大芽孢桿菌能分解土壤中的有機磷成為植物可利用的速效磷；該發明使用的黑曲霉具有產高活力纖維素酶的特性，纖維素酶有利于土壤有機質的分解，腐殖質的形成和碳素營養的釋放。每畝土地使用本發明的肥料的量為50-100克，是目前國內外使用量較少的微生物肥料之一。公布號為CN102888356A的專利申請，公開了一種利用枯草芽孢桿菌制備微生物肥料的方法及其應用。該專利公開了一種利用保藏菌種枯草芽孢桿菌CCTCCM2012287制備的微生物肥料及其制備方法以及應用。利用該菌制備的微生物肥料，可促進甜瓜植株和根系的生長發育，且甜瓜品質有明顯提升、營養成分更高。申請號為201410040955.X的發明專利“一種大顆粒教槽料及其制備方法”，該發明所述大顆粒教槽料，特別添加了先經酶解，再添加枯草芽孢桿菌CICC10063和CGMCCN0.7926混合菌液發酵制備的發酵豆柏，和枯草芽孢桿菌CGMCC N0.7926發酵制備的高溫淀粉酶及其培養物。該發明飼料配方科學合理既能滿足仔豬的營養需求，又能增強飼料的適口性，針對各種原料各自特點進行預處理，不但提高了消化、吸收率，且降低了抗營養因子。
[0004]由于我國長期缺乏在微生物肥料方面的研究投入，使得我國的微生物肥料產業依然存在整體水平不高、技術創新不足、產品質量與應用效果表現欠穩定的問題。在農業可持續發展已成為人類共識的今天，這些問題成了微生物肥行業函待打通的“瓶頸”。


【發明內容】

[0005]本發明提供一種微生態肥及其制備方法。
[0006]本發明的技術解決方案是:一種微生態肥，重量份數組成為:枯草芽孢桿菌培養物10-15，黑曲霉培養物5-10，植物乳桿菌劑20-30份。
[0007]所述植物乳桿菌(Lactobacilluspi ant arum)保藏號為 CGMCC N0.9405。
[0008]所述制備微生態肥的方法:將枯草芽孢桿菌、黑曲霉培養物和植物乳桿菌按比例組合造粒機造粒即可。
[0009]所述枯草芽孢桿菌培養物制備:從斜面轉接培養枯草芽孢桿菌，逐級擴培后的種子液轉接入發酵罐中，發酵完畢發酵液經過板框過濾、干燥后獲得含枯草芽孢桿菌菌劑的培養物。
[0010]植物乳桿菌劑的制備方法:從斜面轉接培養植物乳桿菌，逐級擴培后的種子液轉接入發酵罐中，發酵完畢發酵液經低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5-0.6:1，載體組成為:CaC0320-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0011]黑曲霉培養物制備:菌種培養，固體發酵培養:孢子液接種到固態發酵培養料中，26-33°C培養至菌絲長滿培養料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物；采用常見固態發酵法制備獲得。
[0012]本發明采用的菌種如下:
[0013]枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis subsp)CGMCC 7926 ；
[0014]黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC N0.7927。
[0015]上述菌種的保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。地址:北京市中關村北一條13號中科院微生物研究所；郵編:100080。
[0016]有益效果:
[0017]本發明的肥料由復合微生物發酵而成，能夠改善土壤的微生態環境，為農作物的生長提供有益條件。
[0018]在生物肥料工業上，黑曲霉具有裂解大分子有機物和難溶無機物，便于作物吸收利用，改善土壤結構，增強土壤肥力，提高作物產量的效果。黑曲霉具有解磷的特性，可以利用固定態、吸附態的磷，有效緩解土壤中缺磷的現狀，而且對提高磷肥利用率，減少磷肥的使用所造成的環境污染。
[0019]本發明使用的黑曲霉還具有產高活力纖維素酶的特性，纖維素酶有利于土壤有機質的分解，腐殖質的形成和碳素營養的釋放，用在果類作物上，能使果肉細嫩清脆，果汁豐富，口感良好。
[0020]本發明的肥料營養豐富，有機質含量高，能夠滿足有機食品的生產需要。
[0021]本發明的肥料能夠增強作物的抗病蟲害能力。
[0022]本發明的肥料能夠改良土壤，肥料中有益微生物能產生糖類物質，占土壤有機質的0.1%，與植物粘液、礦物胚體和有機膠體結合在一起，可以改善土壤團粒結構，增強土壤的物理性能和減少土壤顆粒的損失，在一定的條件下，還能參與腐殖質形成。
[0023]本產品使用方法簡單，每畝地使用量0.3-1公斤，拌種或生長期灌水前地表噴灑。

【具體實施方式】
[0024]除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另夕卜，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的反應條件、分離提取條件進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。
[0025]下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例1
[0026]本發明中植物乳桿菌菌株特點如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛，不產芽孢；在固體培養基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態為圓形，邊緣較整齊。
[0027]理化特征為:過氧化氫酶㈠，明膠液化㈠，吲哚實驗⑴，運動性㈠，發酵產氣(-)，亞硝酸鹽還原(_)，發酵產氣(_)，產硫化氫氣體(_)，PH4.0MRS培養基中生長(+)。
[0028]本發明植物乳桿菌采用下述流程進行選育:
[0029]原始出發菌種一試管活化一硫酸二乙酯(DES)誘變一亞硝基胍(NTG)誘變一等離子體誘變一平板初篩一搖瓶復篩一傳代穩定性試驗。
[0030]本發明所采用的出發菌株在MRS葡萄糖培養基中，其乳酸的生產速率為1.5g/L/d,當培養基pH為3.5時幾乎停止生長，對亞硝酸鈉的分解速率為0.34mg/h/kg白菜。出發菌株為李政采集于寧夏鹽池縣育肥羊場的青儲飼料，采集時間2013年9月15日。
[0031]為了提高其乳酸生產速率、耐酸能力和亞硝酸鹽的分解速率，依次采用DES和NTG技術對該菌種進行誘變，誘變后菌株采用MRS碳酸鈣平板進行初篩，然后采用500mL搖瓶發酵，生物傳感器分析儀對高產菌進行復篩，選育優良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實驗，評價其遺傳穩定性。
[0032]植物乳桿菌tlj-2014遺傳穩定性結果表明:經過連續傳代十次，各項性能指標都比較穩定，遺傳性較好，性狀沒有回復，因此把植物乳桿菌tlj-2014作為選育得到的目的菌株。
[0033]經驗證發現:該誘變菌株的乳酸生產速率可以達到35g/L/d，該菌株經過71小時發酵后乳酸濃度達到95g/L ;能夠在pH為1.80的條件下存活。降解亞硝酸鹽速度快，分解能力達到9.8mg/h/kg (自然發酵過程亞硝酸鹽積累的速率大約為1.lmg/h/kg),能夠耐1%膽鹽。
[0034]因此采用該菌種生產泡菜，整個發酵過程中亞硝酸鹽濃度在5mg/kg以下，遠低于國家標準GB2714-2003中規定的含量(20mg/kg)。
[0035]植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) tl j-2014,該菌株已于 2014 年 7 月 2 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵編:100101)，保藏號為CGMCC N0.9405。
[0036]1.DES誘變選育
[0037]I)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌L 一環，接入裝有50mL培養基MRS (無瓊脂，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養12h左右，使菌體處于對數生長前期。
[0038]2)取5mL菌液，5000rpm離心1min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0039]3)用pH7.0磷酸緩沖液稀釋成17個/mL菌懸液。
[0040]4)取32mL pH7.0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0.4mL DES在預先放入轉子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為I % (v/v)。
[0041]5)在 37°C搖床中 150rpm 反應 30min，取 ImL 混合液，加入 0.5mL 25% Na2S203 溶液中止反應。
[0042]6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養基(含100g/L葡萄糖的碳酸鈣MRS培養基)平皿中。在37°C培養2?3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株轉印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養基(低pH值改性MRS培養基)上和亞硝酸鈉篩選培養基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養基)上。
[0043]7)在37°C培養2?3天后，挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養基、亞硝酸鈉篩選培養基上生長并且在碳酸鈣篩選培養基上。經初步篩選，挑取出的菌落命名為植物乳桿菌LI。
[0044]2.亞硝基胍誘變
[0045]I)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌LI 一環，接入裝有50mL培養基MRS (無瓊脂)(葡萄糖濃度為60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養12h左右，使菌體處于對數生長前期。
[0046]2)取5mL菌液5000rpm離心1min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0047]3)用pH6.0磷酸緩沖液稀釋成17個/mL菌懸液。
[0048]4)取1mL菌懸液轉移至10mL三角瓶中，加入1mg的NTG，配制成終濃度為1mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0049]5)在37°C下200rpm振蕩反應30min, 5000rpm離心1min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌數次，中止反應。
[0050]6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養基(含100g/L葡萄糖的碳酸鈣MRS培養基)平皿中。在37°C培養2?3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株轉印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養基(低pH值改性MRS培養基)上和亞硝酸鈉篩選培養基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養基)上。
[0051]7)挑選菌株方法:挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養基、亞硝酸鈉篩選培養基上生長并且在碳酸鈣篩選培養基上。經初步篩選，挑取100支符合以上條件的菌落。
[0052]3.搖瓶復篩
[0053]I)在超凈臺上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環，接入裝有50mL培養基MRS (無瓊脂)(葡萄糖濃度為100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養15h左右，使菌體處于對數生長中期。
[0054]2)分別取5mL菌液，接入裝有50mL碳酸鈣篩選液體培養基(含250g/L葡萄糖的碳酸鈣MRS培養基)平皿中、pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS液體培養基(低pH值改性MRS培養基)和亞硝酸鈉液體篩選培養基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養基)上(注:采用250mL三角瓶)。200rpm，37°C培養3-4天，每天分別檢測碳酸鈣篩選液體培養基中L-乳酸產生速率、LPHMRS液體培養基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養基中亞硝酸鹽的消耗速率。發酵結束后，比較100株菌種的碳酸鈣篩選液體培養基中L-乳酸產生速率、LPHMRS液體培養基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養基中亞硝酸鹽的消耗速率。
[0055]3)選擇兼具高L-乳酸產生速率、耐受低pH (該菌種僅能在最低為pHl.8的培養基中生長)和亞硝酸鹽的消耗速率高的菌株，將其命名為L2菌。
[0056]4.遺傳穩定性試驗
[0057]將L2菌在斜面上連續十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發酵情況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩定性較強。菌株命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014。
[0058]5.5L發酵罐試驗
[0059]I)取斜面上的植物乳桿菌L2 —環，接入裝有50mL培養基MRS (無瓊脂)(葡萄糖濃度為150g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養12h左右，使菌體處于對數生長中期。
[0060]2)將對數期的菌種接入裝有3L MRS液體培養基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發酵罐中。接種量為10%，37°C下10rpm培養8小時，對數前期溶氧控制10% (通氣0.5L/min)，后期厭氧培養63小時。發酵結束后，植物乳桿菌L2的乳酸產量達到95g/L。這樣的產乳酸速率利于泡菜的快速發酵。
[0061]3)將對數期的菌種接入裝有3L pH為1.8的LPHMRS液體培養基(初始葡萄糖為50g/L)的5L發酵罐中。接種量為10%，37°C下10rpm培養8小時，對數前期溶氧控制10%(通氣0.5L/min)，后期厭氧，整個過程用0.5mol/L的氫氧化鈉將發酵液pH控制在1.8，總培養時間為48小時。發酵結束后，檢測植物乳桿菌L2的生物量為2.5g/L，說明植物乳桿菌L2能夠在pHl.8的環境中生存。
[0062]4)將對數期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養基)的5L發酵罐中。接種量為10%，37°C下10rpm培養8小時，對數前期溶氧控制10% (通氣0.5L/min)，后期厭氧，發酵過程根據亞硝酸鹽的消耗速率流加20g/L的亞硝酸鈉溶液，培養2-3天。發酵結束后，計算發酵過程植物乳桿菌L2對亞硝酸鈉的降解速率。結果發現:在該條件下，L2對亞硝酸鈉的降解速率可以達到563mg/h/L0
[0063]5)將對數期的菌種1mL接入裝有2kg預處理過的白菜中，按照傳統泡菜方法進行加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結果發現，在整個發酵過程中，L2菌對亞硝酸鈉的分解速率為9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于5mg/kg，遠低于國家標準GB2714-2003中規定的含量(20mg/kg)。
[0064]枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) L1-2013-02,該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.7926。
[0065]所述菌株特性是產耐高溫α -淀粉酶的酶活力高，耐熱、耐酸性強。
[0066]所述菌株制備的耐高溫α -淀粉酶酶活力為30000-35000u/ml ;適用溫度范圍為105-115°C，最適反應溫度110°C，在110°C酶活完全穩定；適用反應pH值范圍為3.0-7.0，在PH值為3.0時酶活完全穩定，最適反應pH值為4.2。
[0067]所述菌株特點如下:
[0068]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實驗成陽性。
[0069]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)L1-2013-02由一株產耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013經紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下:
[0070](I)菌懸液的制備
[0071]將在平板劃線分離后長出的L1-2013單菌落接入種子培養基中，100r/min，40°C培養12h后,取ImL培養液離心后用生理鹽水洗漆兩次,并重懸與9mL生理鹽水中。
[0072](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變
[0073]將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經過照射的菌液經梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經紫外照射的菌液稀釋涂平板做對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置40°C培養48h，在長出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0074](3)高產菌種的初篩
[0075]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03。
[0076](4)搖瓶發酵復篩
[0077]將獲得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03在含有30mL發酵培養基的250mL搖瓶中進行搖瓶發酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、100r/min培養72h，離心取發酵上清液制得粗酶液。
[0078](5)酶活測定
[0079]酶活單位的定義:lmL粗酶液,于105°C、pH 4.2條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，
[0080]即為I個酶活力單位，以U/mL表示。
[0081]經測定，菌株L1-2013-02，為穩定的最高產菌株，且酶活達到30000U/mL。
[0082]所述氯化鋰平板:淀粉I %，蛋白胨 I %，(NH) 2S040.4 %，K2HPO40.8%, CaCl20.2%,氯化鋰0.9%,瓊脂2%。
[0083]所述的種子培養基:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0084]所述的發酵培養基:玉米粉5% -15%，豆餅粉4% -10%，(NH)2SO40.4 %,K2HPO40.8%, CaCl20.2% 0
[0085]所述的搖瓶培養條件:該菌在含有30mL發酵培養基的250mL搖瓶中，接種量10%(V/V)，100r/min、40°C 發酵培養 72h。
[0086]所述耐高溫的α -淀粉酶，其酶學性質如下:
[0087](I)該酶溫度適應范圍較寬，最適作用溫度在100-110°C之間，且在110°C以下保存的，溫度穩定性較好，而110°c以上保存長時間溫度穩定性較差。
[0088](2)該酶最適反應pH值為4.2。在pH值3.0_7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0時酶活完全穩定。
[0089](3)酶活性:由本發明所提供的突變株L1-2013-02，制備的耐高溫α -淀粉酶酶活力為 30000-35000U/ml。
[0090]本發明提供的黑曲霉(Aspergillus niger)L1-2013-03是由天津工業大學實驗室保藏的一株產纖維素酶的黑曲霉(Aspergillus niger)L1-2010經亞硝基胍多輪誘變篩選，然后對優良菌株經發酵性能測試篩選得到產高活力纖維素酶的黑曲霉菌株(Aspergillusniger)L1-2013-03。
[0091]本發明提供的產高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉(Aspergillus niger)L1-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵編100101)，保藏號為 CGMCC N0.7927。
[0092]本發明黑曲霉菌株(Aspergillusniger) L1-2013-03 (CGMCC N0.7927)具有以下微生物學特征:
[0093]1、形態學特征:
[0094]黑曲霉菌株CGMCC N0.7927，生物學形態為包括分生孢子、胞梗、頂囊、產胞結構等幾部分。分生孢子頭球形至輻射形，直徑150-450 μ m，分生孢子梗發生于基質。胞梗莖1000-3000 (長度)X 12-20 (直徑)μ m，黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近似球形，直徑45-75 μ m,表面全面可育；產胞結構雙層，梗基10-20 (長度)X 4.5-7.0 (直徑)μ m,瓶梗6-10 (長度)X 2.5-3.5 (直徑)μ m，分生孢子球形或近球形，直徑3-4.5 μ m,褐色，壁粗糙。
[0095]2、培養學特征:
[0096]菌株在麥芽汁瓊脂培養基上生長迅速，28 V 4天孢子可鋪滿斜面；質地絲絨狀或稍帶絮狀；分生孢子結構大量，褐黑色，無滲出液；菌落反面略帶黃色。
[0097]3、生理生化特征:
[0098]黑曲霉菌株CGMCC N0.7927可在玉米秸桿、稻草、木屑、馬鈴薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生長，最適pH范圍5-6，最適生長溫度范圍28-33°C，最適產酶溫度范圍28-30。。。
[0099]本發明黑曲霉菌株CGMCC N0.7927的篩選技術路線為:出發菌株一斜面培養一孢子懸液的制備一誘變處理一平板分離一初篩一復篩一遺傳穩定性測定一擴大實驗(發酵性能測定)。
[0100]按誘變篩選方案，對突變株逐級篩選淘汰，最后對優良菌株經發酵性能測試篩選，得到一株高產酶性能菌株黑曲霉菌(Aspergillus niger) L1-2013-03，發酵96小時后纖維素酶的外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL。
[0101]28°C發酵4天直徑75mm，發酵液纖維素酶的的外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分別比出發菌株提高了 9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
[0102]產高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0103]I)斜面培養:將原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li_2010劃線接種斜面培養基，30°C培養2?3d，直至菌絲體成熟、產大量黑色孢子。所述斜面培養基組成如下:120Brix 麥芽汁 100mL, pH 值自然，121°C滅菌 20min ；
[0104]2)孢子懸液制備(以下步驟均在無菌條件下操作):向試管斜面加入15mL無菌水，把孢子刮下，用濾紙過濾，將濾過液倒入已滅菌、并加有5-10粒無菌玻璃珠的150mL三角瓶中，將三角瓶放入搖床振蕩10-15min，使孢子分散。
[0105]3)亞硝基胍(NTG)誘變
[0106]①用無菌水將孢子懸浮液調節為稀釋成106-107個/mL。
[0107]②取1mL菌懸液轉移至10mL三角瓶中，加入1mg的NTG，配制成終濃度為1mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0108]③在30°C下200rpm振蕩反應30min, 5000rpm離心1min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌數次，中止反應。
[0109]④適當稀釋將孢子濃度調節為103個/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養基上。在30°C培養2?3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容100mL, pH 值 5-6，121°C 滅菌 20min)。
[0110]⑤復篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養基，30°C培養至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復篩培養基的250mL三角瓶中進行發酵，接種量10% (V/V)，30°C、100r/min培養96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。(所述復篩培養基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容lOOOmL，pH值5_6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進行放大實驗。
[0111]4)遺傳穩定性試驗
[0112]將L1-2013-03菌株在斜面上連續十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發酵情況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩定性較強。
[0113]5)放大試驗
[0114]①種子培養:將纖維素酶酶活力最高的菌株(Aspergillus niger)L1-2013-03接入500mL三角瓶中，種子培養基裝量100毫升，30°C、150rpm搖床培養72_96h。
[0115]②種子罐培養:將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發酵液的1L發酵罐中，控制pH值恒定為6.0±0.2，培養溫度30±0.1 °C，攪拌速度300rpm，通風量(v/V) 1:0.8-1.2，培養時間96h，溶解氧20-30%。所述發酵培養基組成為:纖維素粉10gjt酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容lOOOmL，pH值5_6，121°C滅菌20min。
[0116]發酵結束后，取發酵上清液(粗酶液)進行酶活力檢測經測定，菌株(Aspergillusniger) L1-2013-03的外切β-葡聚糖酶、內切β _葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL,分別比出發菌株(Aspergillus niger)L1-2010 提高了 9.21 倍、7.43 倍、8.15 倍和 10.31 倍。
[0117]實施例2
[0118]一種微生態肥，其重量份數組成為:枯草芽孢桿菌培養物15，黑曲霉培養物8，植物乳桿菌劑25份。
[0119]所述植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)保藏號為 CGMCC N0.9405 ；
[0120]枯草芽孢桿菌培養物的制備方法:
[0121]發酵液的獲得:采用斜面菌種逐級擴培獲得枯草芽孢桿菌發酵液；
[0122](I) 一級種子培養:將枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0123](2) 二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；
[0124](3)三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0125](4) 一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度28°C，攪拌速度100轉/分，通風量(V/V)1:0.5，罐壓0.05MPa,培養時間24小時；
[0126](5)發酵培養:將一級種子罐菌種以10%接種量接入總容積為1.5噸二級種子罐，發酵培養基裝量I噸，培養條件培養溫度28 °C，攪拌速度100轉/分，通風量(V/V) 1:0.5，罐壓0.05MPa，培養時間24小時。發酵液板框過濾后干燥獲得。
[0127]培養基組成:葡萄糖6%，酵母提取物1%，蛋白胨0.2%，CaC03l%，pH6.8。
[0128]植物乳桿菌劑的制備方法:
[0129](I) 一級種子培養:將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0130](2) 二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500暈升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；
[0131](3)三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0132](4) 一級種子罐培養:將三級種子以5%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度30°C，罐壓0.05MPa,培養時間18小時；
[0133](5)發酵罐培養:將一級種子罐菌種以5%接種量接入總容積為3噸二級種子罐，發酵培養基裝量2噸，培養條件培養溫度30°C，罐壓0.05MPa,培養時間22小時。發酵完畢發酵液經低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaC0325份，糊精12份，流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0134]培養基組成為:酪蛋白胨I %，牛肉提取物I %，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5 % ,乙酸鈉 0.5 %，檸檬酸二胺 0.2 %，Tween 800.1 %，K2HPO40.2 %，MgSO4.7H20
0.02% , MnSO4.H2O 0.005% , CaC032%，瓊脂 1.5%，pH6.8。
[0135]黑曲霉培養物的制備方法:
[0136]斜面菌種活化培養:將黑曲霉斜面菌種轉接到斜面培養基上，27°C培養3天；
[0137]固體一級種子培養:挑取黑曲霉斜面菌種接入裝有100克培養基的500毫升三角瓶中進行種子培養，30°C培養3天即可；
[0138]固體二級種子培養:將上述培養好的固體一級種子攪拌為碎塊后加入裝有1000克培養基的5000毫升三角瓶中進行種子培養，培養條件:30°C培養3天即可；
[0139]固體發酵培養:將二級搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養基的發酵池或托盤中混合均勻后培養，曲料培養溫度控制在26-35°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次，培養時間5-7天；固體曲料的培養采用常用曲料培養技術；待培養料長滿菌絲即可結束培養，培養基預先經高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度121°C，時間I小時；
[0140]干燥粉碎:發酵結束培養料在流化床或其他干燥設備上進行干燥，干燥溫度控制在60°C，干燥到水分含量在10%以下，然后將固體培養料進行粉碎，物料粉碎孔徑在60目以上；
[0141]培養基組成:固體原料:麩皮80%，豆餅粉10%，玉米淀粉10%，添加等量自來水；初始pH自然。
[0142]實施例3
[0143]一種微生態肥，重量份數組成為:枯草芽孢桿菌培養物13，黑曲霉培養物5，植物乳桿菌劑20份。
[0144]所述植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)保藏號為 CGMCC N0.9405。
[0145]實施例4
[0146]一種微生態肥及，重量份數組成為:枯草芽孢桿菌培養物10，黑曲霉培養物10，植物乳桿菌劑30份。
[0147]植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)保藏號為 CGMCC N0.9405。
[0148]實施例4
[0149]產品效果實驗
[0150]試驗地的選擇與試驗設計:試驗于2013年3月30日一10月28日在寧夏鹽池縣花馬池鎮八堡村進行。
[0151]試驗田達到田種植玉米10畝,分別在種植時使用本發明產品每畝0.5公斤，出苗I個月左右通過鋤地松土方式使用發明產品0.5公斤，對照組使用常規肥料。
[0152]發明產品使用玉米地玉米產量達到750公斤，對照組達到500公斤；該地塊在第2年種植春小麥，春小麥產量達到了 480公斤，比對照組單產提高了 29%。且試驗田土壤結構良好，無大塊和板結。
【權利要求】
1.一種微生態肥，重量份數組成為:枯草芽孢桿菌培養物10-15，黑曲霉培養物5-10，植物乳桿菌劑20-30份。
2.根據權利要求1所述一種微生態肥，其特征在于，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)保藏號為 CGMCC N0.9405。
3.根據權利要求1所述一種微生態肥，其特征在于，重量份數組成為:枯草芽孢桿菌培養物15，黑曲霉培養物8，植物乳桿菌劑25份。
4.根據權利要求1所述一種微生態肥，其特征在于，重量份數組成為:枯草芽孢桿菌培養物13，黑曲霉培養物5，植物乳桿菌劑20份。
5.根據權利要求1-4所述微生態肥的制備方法，將枯草芽孢桿菌、黑曲霉培養物和植物乳桿菌按比例組合造粒機造粒即可。
【文檔編號】C05F11/08GK104355689SQ201410521659
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】邵素英 申請人:天津天綠健科技有限公司