專利名稱：文心蘭離體葉片誘導體胚的方法
技術領域：
本發明涉及文心蘭組織培養的方法，特別是一種從文心蘭離體葉片誘導體胚并最 終獲得再生植株的方法，屬于生物技術和現代農業技術領域。
背景技術：
文心蘭i/hcidiuni flexuosum Lodd),又名舞女蘭、瘤瓣蘭，為蘭科 (flrcAii/aceae)瘤瓣蘭屬iXhcidiwn 5k )植物，是世界花卉業重要的盆花和切花種類之 一。文心蘭無論屬內雜交還是屬間雜交，其親和力都較差、授粉結實機率低，通過雜交培育 新品種難度大、周期長，采用新技術新方法獲得文心蘭新品種將是未來文心蘭育種的重要 途徑。能生成單細胞體胚的葉片是上佳的育種材料和轉基因受體材料。Chen and Chang 首先報道了文心蘭(Oncidium Gower Ramsey)離體葉片在添加TDZ的改良1/2MS培養基 上誘導出了直接體胚，這些體胚能形成原球莖，進而發育成正常的植株(Chen and Chang, Plant Cell Rep, 1999，19: 143-149)。文心蘭離體葉片的葉尖、葉面、葉背、葉緣、葉切口 均能形成體胚，培養基的成分和植物生長調節劑以及品種差異對文心蘭離體葉片誘導體胚 有很大影響(Su, Chen and Chang. Biologia Plantarum，2006，50 (1):107_110)。建立高 效穩定的葉片體胚誘導及再生體系是開展文心蘭生物技術育種工作的關鍵步驟之一。
發明內容
采用目前的組織培養體系，文心蘭離體葉片的葉尖、葉面、葉緣、葉中切口、葉基部 切口均能形成體胚，這些體胚能迅速增殖并形成原球莖，與其他外植體獲得的原球莖沒有 差異，最終能成為正常植株。文心蘭離體葉片誘導生成的體胚，源自葉片表皮或葉肉單一細 胞，非常適合應用于育種領域，如多倍體育種、轉基因育種等。但文心蘭離體葉片體胚誘導 率較低，一般不超過30%，且誘導率很不穩定，本發明主要通過選擇適宜的葉片外植體、優化 培養條件來提高文心蘭離體葉片體胚誘導率和穩定性，使文心蘭離體葉片的體胚誘導率保 持在90%以上，為文心蘭育種提供了大量源于葉片的胚性單細胞，這些能形成體胚-類原球 莖并可獲得再生植株的胚性單細胞是轉基因育種工程的最佳受體細胞。本發明的具體描述如下
(1)通過組織培養可獲得大量的無菌文心蘭幼苗，這些幼苗起初往往是叢生的，按其形 態發育特性可分為無根幼苗和帶根幼苗，盡管無根幼苗和帶根幼苗剪下的葉片都能生成體 胚，但無根苗和帶根苗的生理狀態是有差異的，帶根幼苗離體葉片的體胚誘導率是無根的 2-3倍，選擇帶根幼苗作為外植體供體能顯著提高文心離體葉片體胚誘導率。(2)文心蘭無菌試管苗中的幼葉處于最初的生長階段，其葉片的長短與生長時間 呈正相關，葉片的長短在一定程度上顯示了葉齡和苗齡。實驗表明葉片長度對體胚誘導率有顯著影響，小于10毫米的葉片體胚誘導率低于15%，長度為25-30毫米的葉片體胚誘導率 為30%，當葉片長度大于30毫米時，葉片體胚誘導率僅為12%，當葉片長度為12-22毫米，葉 片體胚誘導率超過90%。選擇適宜的葉片長度，對于維持較高的體胚誘導率至關重要，文心 蘭離體葉片最適宜的尺寸是15毫米-22毫米，文心蘭無菌幼苗的長度最好在15毫米-25 毫米范圍(不計根的長度)。(3)植物生長調節劑是影響文心蘭離體葉片體胚誘導的關鍵因子之一。噻苯隆 (TDZ)、6-芐基腺嘌呤和細胞激動素具有強烈促進細胞分裂的作用，三種植物生長調節劑 單獨使用時，對文心蘭離體葉片體胚誘導均具有強烈的促進效果，其中TDZ的效果要好于 6_芐基腺嘌呤和細胞激動素；通常三種植物生長調節劑使用的濃度范圍分別是TDZ 0. 1毫 克-3毫克/升，6-芐基腺嘌呤0. 5毫克-3毫克/升，細胞激動素0. 5毫克-3毫克/升。 TDZ),6-芐基腺嘌呤和細胞激動素的組合使用能有效促進文心蘭離體葉片體胚誘導率。較 好的組合是以TDZ為主，再添加適量的6-芐基腺嘌呤或細胞激動素。比較適宜的植物生長 調節劑添加方案是TDZ0. 3毫克-0. 5毫克/升+ 6-芐基腺嘌呤0. 5毫克-1. 0毫克/升。(4)在文心蘭組織培養過程中，文心蘭離體葉片的褐化尤其是從葉片的切口處出 現的褐化現象是嚴重影響體胚誘導率的關鍵因素之一。褐化通常是在葉片離體培養10天 左右出現，最初發生的部位是葉基部切口和葉片中切口邊緣，顏色由淡褐色逐漸加深至深 褐色或黑色，葉片一旦出現褐化，基本上無法誘導形成體胚。文心蘭離體葉片培養過程中出 現的褐化與常規植物組織培養中出現的褐化現象相類似，是由植物細胞中酚類化合物被氧 化產生褐色的酚醌類化合物。在培養基中添加活性碳和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)能有效 控制文心蘭離體葉片褐化的發生。兩者添加濃度范圍均為100毫克-1000毫克/升，較合 適的組合是活性碳100毫克-200毫克/升，PVPP 100毫克-300毫克/升。(5)在文心蘭離體葉片培養時，鐵鹽的濃度對離體葉片和葉片切口的褐化有較大 影響。適度降低培養基中鐵離子的濃度，對減少文心蘭離體葉片的褐化率和減輕褐化程度 有較好效果。二價鐵鹽在培養基中的濃度范圍是5毫克-20毫克/升，比較適合的鐵鹽濃 度是10毫克-15毫克/升。(6)文心蘭離體葉片的葉尖、葉面、葉背、葉緣、葉切口均能形成體胚，在一般情況 下，葉尖是最易形成體胚的部位(Chen and Chang, Plant Cell, 2002,69 41-44)。當我們 需要提高文心蘭離體葉片切口(傷口)的體胚誘導率時，可選擇以下2種方法(根據需要2 種方法可同時使用)1)剪去離體葉片的葉尖(1-3毫米)或在葉片中部剪一寬度為葉片寬 1/2的口子，以增加切口的長度和面積，提高體胚誘導率。但要注意控制切口長度與葉面積 的比率，不能使葉片受傷過度；2)適當提高TDZ的濃度。在較低濃度下(TDZ0. 1毫克/升一 TDZ0. 3毫克/升)，離體葉片葉尖就具有較高的體胚誘導率，將TDZ增加到0. 5毫克/升，可 顯著增加離體葉片切口的體胚誘導率。
具體實施例方式實施例1
文心蘭“百萬金幣”(Oncidium ‘Million Dollar，)原球莖轉入培養基(MS基本培養基 添加磷酸二氫鈉170mg毫克/升，谷胺酰胺500毫克/升，吲哚丁酸(IBA) 1.0毫克/升， 谷胺酰胺500毫克/升，活性碳1000毫克/升，蔗糖30，000毫克/升，瓊脂7，000毫克/升，ρΗ5· 5)，培養溫度24-26°C，光照時間16h/d，光照強度為1200_16001x。每隔60天換一 次培養基，選取15毫米-25毫米長的帶根幼苗作為外植體供體。葉片處理 將葉片從基部剪下，在葉片中間剪一寬度約為一半葉寬的口子，近軸 面朝上置于培養基上，每一培養皿(直徑90毫米)中放入8-12片葉片。體胚誘導培養基基本培養基為1/2 MS (Murashige T, Skoog F, 1962)培 養基(其中微量元素和有機添加物為全量，鐵鹽減半)，其他添加物為磷酸二氫鈉170毫克/ 升，谷胺酰胺1000毫克/升，蛋白胨1000毫克/升，TDZ 0. 30毫克/升，6-芐基腺嘌呤1. 0 毫克/升，PVPP300毫克/升，活性碳200毫克/升蔗糖20，000毫克/升，8611^丨6 2,800 毫克/升，ρΗ5· 2，121°C滅菌15分鐘。培養條件暗培養，培養溫度24-26 °C。
培養60天后，絕大多數文心蘭離體葉片生成體胚，轉入光照培養(溫度24-26°C， 光照時間16h/d，光照強度為1200-16001x) 20-30天，此時體胚發育成原球莖，即可轉入文 心蘭常規組織培養體系，獲得再生植株。實施例2
文心蘭“百萬金幣”(Oncidium ‘Million Dollar，)原球莖轉入培養基(MS基本培養基 添加磷酸二氫鈉170mg毫克/升，谷胺酰胺500毫克/升，吲哚丁酸(IBA) 1.0毫克/升， 谷胺酰胺500毫克/升，活性碳1000毫克/升，蔗糖30，000毫克/升，瓊脂7，000毫克/ 升，ρΗ5· 5)，培養溫度24-26°C，光照時間16h/d，光照強度為1200_16001x。每隔60天換一 次培養基，選取15毫米-25毫米長的帶根幼苗作為外植體供體。葉片處理 將葉片從基部剪下，剪去葉片頂端約1-3毫米，近軸面朝上置于培養 基上，每一培養皿(直徑90毫米)中放入8-12片葉片。體胚誘導培養基基本培養基為1/2 MS (Murashige T, Skoog F, 1962)培 養基(其中微量元素和有機添加物為全量，鐵鹽減半)，其他添加物為磷酸二氫鈉170毫克/ 升，谷胺酰胺1000毫克/升，蛋白胨1000毫克/升，TDZ 0. 50毫克/升，6-芐基腺嘌呤1. 0 毫克/升，PVPP500毫克/升，活性碳200毫克/升蔗糖20，000毫克/升，8611^丨6 2,800 毫克/升，ρΗ5· 2，121°C滅菌15分鐘。培養條件暗培養，培養溫度24_26°C。
培養60天后，絕大多數文心蘭離體葉片切口處生成體胚，轉入光照培養(溫度 24-26°C，光照時間16h/d，光照強度為1200-16001x) 20-30天，此時體胚發育成原球莖，即 可轉入文心蘭常規組織培養體系，獲得再生植株。
權利要求
一種從文心蘭離體葉片高效誘導體胚的方法，其特征在于以取自文心蘭(Oncidium flexuosum)“百萬金幣”無菌幼苗的離體葉片為外植體，培養基為添加TDZ(噻苯隆，thidiazuron)、6 芐基腺嘌呤和細胞激動素的改良1/2MS培養基，20 28℃暗培養50 60天，絕大部分葉片可誘導生成體胚，繼續培養可形成類原球莖，并最終獲得正常的再生植株。
2.根據權利要求1所述的文心蘭腫/Y^rao1S腫)，是指蘭科(Orchidaceae)瘤 瓣蘭屬(Oncidium)的植物，包括與文心蘭(itocii/i flexuosum)的雜交品種，包括但不 限于如下品種南茜Gower Ramsey)火山皇后伽ee/ )、野貓 Colmanara wildcat) ^QloAlxxre (One. Golden Shower)霓虹雪影Ralph Yagi Jon)、 甜蜜蜜(itoc. Sharry fe知)、黛麗絲(^c. Pink Deluxe，Maroon ite/i勸 ，)、雅露賓 (One. Kra thoomban )、艾 _ 莎(itoc. Ralph yagielsa )、金色回憶(Golden Anni versary 歷7 /ο·5)、蜜糖(One. Sweet Sugar)、羅漢(One. Aloha Iwanaga) (One. Million Dollar)。
3.根據權利要求1所述的文心蘭無菌幼苗，其特征為葉片長度為10毫米-30毫米的帶 根或不帶根的幼苗。
4.根據權利要求1所述的文心蘭無菌苗離體葉片，其特征為從幼苗葉基部剪取長度 8-30毫米的完整葉片，為增加體胚誘導的數量，可剪去葉尖部位(約1-3毫米)或可在葉片 中部剪一寬度約為葉寬一半的口子。
5.根據權利要求1所述的在培養基中添加植物生長調節劑TDZ(噻苯隆， thidiazuron),6-芐基腺嘌呤和細胞激動素成分，其特征為至少添加TDZ、6_芐基腺嘌呤和 細胞激動素三種成分的一種或三種成分的組合，TDZ、6-芐基腺嘌呤和細胞激動素在培養基 中的濃度范圍均為0. 1毫克_3毫克/升；效果較好的一種組合是TDZ 0. 5毫克/升+6-芐 基腺嘌呤1毫克/升。
6.根據權利要求1所述的改良1/2MS培養基，其特征為在培養基中添加抗褐化劑活性 碳和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)兩種成分的一種或兩種成分的組合，兩種成分濃度范圍均為 100毫克-1000毫克/升，比較合適的組合是活性碳100毫克-200毫克/升，PVPP 200毫 克-500毫克/升。
7.根據權利要求1所述的改良1/2MS培養基，其特征在于減少培養基中二價鐵鹽的用 量，以FeSO4Jl2O計，二價鐵鹽在培養基中的濃度范圍是5毫克-20毫克/升，比較適合的鐵 鹽濃度是10毫克-15毫克/升。
全文摘要
本發明公開了從文心蘭離體葉片誘導體胚并最終獲得再生植株的方法，屬于生物技術和現代農業技術領域。本發明以文心蘭(Oncidiumflexuosum)“百萬金幣”無菌苗葉片為外植體，培養基為添加TDZ、6-芐基腺嘌呤和細胞激動素的改良1/2MS培養基，24-26℃暗培養50-60天，90%以上的葉片能誘導生成體胚，體胚發生的位置在葉尖、葉切口、葉面和葉緣，這些體胚均能進一步發育成類原球莖(PLBs)，最終獲得正常的再生植株。采用本發明建立的文心蘭離體葉片-體胚-植株再生體系，為文心蘭育種提供了大量源于葉片的胚性單細胞，這些能形成體胚-類原球莖并可獲得再生植株的胚性單細胞是轉基因育種工程的最佳受體細胞。
文檔編號A01H4/00GK101940162SQ20101050341
公開日2011年1月12日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者喬桂榮, 劉明英, 卓仁英, 李海營, 蔣晶, 謝麗華, 邱文敏 申請人:中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所;蔣晶