一種玉米幼胚高效誘導繼代培養基及制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種玉米幼胚高效誘導繼代培養基，由包括維生素母液1.5mL、誘導愈傷培養基1L和硝酸銀溶液100μL制備而成，誘導愈傷培養基由包括：N6培養基粉末3.99g/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.002-0.004g/L，脯氨酸2.5-3.5g/L，酪蛋白水解物0.1-0.2g/L，肌醇0.1-0.3g/L，蔗糖30-40g/L，嗎啉乙磺酸0.5g/L。其制備方法包括滅菌；誘導愈傷培養基原料溶解、定容、調pH值，加入植物凝膠，高溫滅菌；冷卻，加入維生素母液、硝酸銀溶液，制得誘導繼代培養基。本發明愈傷誘導率高、生長速度快、培養基效期長，從誘導愈傷到愈傷的持續繼代培養，使用同一種培養基。
【專利說明】一種玉米幼胚高效誘導繼代培養基及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及玉米組織培養【技術領域】，具體涉及一種玉米幼胚高效誘導繼代培養基及制備方法。
【背景技術】
[0002]玉米是一種重要的單子葉模型植物，廣泛應用于基因組學、分子生物學、遺傳學等研究。玉米幼胚所誘導的愈傷在遺傳轉化、研究植物生長發育規律、種質快繁、種質改良等方面具有重要意義。目前，玉米幼胚誘導愈傷過程中主要使用的培養基配置程序繁瑣、繼代時間間隔短、耗費人工、存在愈傷畸形率及褐化率高等問題，限制了幼胚誘導愈傷的應用。
【發明內容】
[0003]針對現有技術不足，本發明的目的是提供一種玉米幼胚高效誘導繼代培養基及制備方法，具有簡便易行、操作簡便、提高愈傷誘導率等優點。
[0004]為實現上述目的，本發明提供一種玉米幼胚高效誘導繼代培養基，由包括維生素母液1000*1.5mL、誘導愈傷培養基IL和硝酸銀溶液100 μ L制備而成。
[0005]所述誘導愈傷培養基由包括下述組分的原料制備而成:Ν6培養基粉末3.99g/L，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.002-0.004g/L，脯氨酸 2.5-3.5g/L，酪蛋白水解物 0.1-0.2g/L，肌醇 0.1-0.3g/L，蔗糖 30-40g/L,嗎啉乙磺酸(MES)0.5g/L。
[0006]優選的，所述誘導愈傷培養基由包括下述組分的原料制備而成:N6培養基粉末
3.99g/L，2，4-二氯苯氧乙酸0.003g/L，脯氨酸2.8g/L，酪蛋白水解物0.2g/L，肌醇0.lg/L,蔗糖35g/L，嗎啉乙磺酸0.5g/L。
[0007]優選的，所述維生素母液由包括下述組分的原料制備而成:維生素B10.6g/L、維生素 B60.6g/L、煙酸 0.5g/L,泛酸 0.5g/L。
[0008]優選的，所述硝酸銀溶液的濃度為50mM。
[0009]本發明還提供了上述培養基的制備方法，包括以下步驟:
[0010]I)將維生素母液、硝酸銀溶液滅菌，-20°C保存備用；
[0011]2)將誘導愈傷培養基原料溶解，定容至1L，調PH值至5.8，加入植物凝膠，將誘導愈傷培養基進行高溫滅菌；
[0012]3)誘導愈傷培養基冷卻至50°C時，加入維生素母液、硝酸銀溶液，制得誘導繼代培養基。
[0013]優選的，所述步驟2)中植物凝膠的加入量為2_4g/L。
[0014]優選的，步驟I)中所述滅菌為抽濾滅菌或高溫滅菌。
[0015]進一步地,步驟I)中所述滅菌為抽濾滅菌。
[0016]優選的，步驟2)中所述高溫滅菌的溫度為121°C，滅菌時間為30min。
[0017]優選的，步驟3)制得誘導繼代培養基分裝入90mm無菌培養皿中，50皿，密封，4-20°C保存，培養基效期為60天。
[0018]本發明還提供了上述制備方法制得的培養基應用于玉米愈傷組織的誘導和繼代培養。
[0019]本發明與現有技術相比，具有以下優點:
[0020]I)本發明額外配置維生素母液，抽濾滅菌，在培養基滅菌后，冷卻至50°C添加，充分保持了維生素的活性，保證了維生素的抗氧化性及愈傷的營養供應。有別于現有技術添加維生素粉末，經過高溫滅菌，活性喪失。特別添加酪蛋白水解物促進愈傷生長。
[0021]2)本發明中從誘導愈傷到愈傷的持續繼代培養，都只使用了一種培養基，有別于現有技術中首先使用誘導愈傷培養基(誘導幼胚生成愈傷)，兩周后使用繼代培養基(持續培養愈傷)。因此，便于操作，節約成本。
[0022]3)本發明中得到的愈傷褐化率低于現有技術的50%，且畸形愈傷不足I %，在現有技術中畸形愈傷率為5%。
[0023]4)本發明得到的愈傷繁殖率高，為97%以上，高于現有技術的60%以上。
[0024]5)本發明愈傷誘導率高、生長速度快、培養基效期長，適用于商業化玉米愈傷誘導。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為實施例1中誘導出的玉米Hi II愈傷。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0027]試驗開始10天后，根據幼胚是否膨大，判定愈傷誘導率。
[0028]試驗開始45天后(此時受體材料繼代一次以上，愈傷狀態有明顯差異)，根據愈傷狀態，判定畸形率及褐化率。
[0029]愈傷狀態:
[0030]I型:白色，結構致密，堅硬，干燥，表面皺起，生長速度緩慢，易發生器官分化，不能長期繼代；
[0031]II型:乳白色，結構松散，較濕潤，可以長期繼代；
[0032]III型:黃褐色，水浸狀，生長慢的愈傷，不能長期繼代。
[0033]公式:
[0034]愈傷誘導率=膨大的幼胚數/幼胚總數；
[0035]畸形率=I型愈傷數/愈傷總數；
[0036]褐化率= III型愈傷數/愈傷總數。
[0037]實施例1
[0038]1、玉米幼胚高效誘導繼代培養基的配方
[0039]由包括維生素母液、誘導愈傷培養基和硝酸銀溶液制備而成，
[0040]維生素母液由包括下述組分的原料制備而成:維生素B1.6g/L、維生素B60.6g/L、煙酸 0.5g/L，泛酸 0.5g/L；
[0041]誘導愈傷培養基由包括下述組分的原料制備而成:N6培養基粉末3.99g/L，2，4- 二氯苯氧乙酸0.003g/L,脯氨酸2.8g/L，酪蛋白水解物0.2g/L，肌醇0.lg/L,蔗糖35g/L,嗎啉乙磺酸0.5g/L。
[0042]2、培養基的制備方法
[0043]包括以下步驟:
[0044]I)將維生素母液、硝酸銀溶液進行抽濾滅菌，-20°C保存備用；
[0045]2)將誘導愈傷培養基原料溶解，調PH值至5.8，加入植物凝膠3g/L，將誘導愈傷培養基進行高溫滅菌，滅菌的溫度為121°C，滅菌時間為30min。；
[0046]3)誘導愈傷培養基冷卻至50°C時，加入維生素母液1.5mL, 50mM的硝酸銀溶液100 μ L，制得誘導繼代培養基，分裝入90mm無菌培養皿中，50皿，密封，4_20°C保存，培養基效期為60天。
[0047]3、玉米Hi II幼胚高效誘導愈傷
[0048]I)幼穗選取:選取自花授粉10-12天的玉米Hi II幼穗，要求生長良好、無蟲口，玉米籽粒成乳白色，尚未灌漿。
[0049]2)去掉玉米穗的苞葉，于75%酒精中浸泡5min，其間不時攪動，使其充分消毒滅菌，然后將酒精濾除，這是第一步滅菌。
[0050]3)在上一步的基礎上，重新加入75%酒精，浸泡15min，其間不時攪動，使其充分消毒滅菌，這是第二步滅菌， 然后濾除酒精，幼穗放入超凈工作臺備用。
[0051]4)用解剖刀在玉米粒底部將玉米粒從玉米棒上剝下，將解剖刀插入玉米粒中，將幼胚取出。
[0052]5)將幼胚轉移到誘導繼代培養基，使盾片朝上，90mm培養皿中接種60個幼胚，培養條件為25 °C，暗培養。
[0053]6) 7天后，對膨大的I型愈傷進行繼代，培養基同步驟5)，90mm培養皿中接種50塊愈傷。
[0054]7)此后，每15天繼代一次，隨著愈傷的增加，培養皿中的愈傷塊數逐漸減少，保證每塊愈傷來自一個幼胚。這時的愈傷蓬松，色白，大小均一，無組織結構。
[0055]8)30天后，將來自一個幼胚的愈傷分成50mm*50mm的小塊，90mm培養皿中接種30塊愈傷，完成了愈傷誘導。
[0056]參見圖1，誘導出的玉米Hi II愈傷已經繼代4次，可見愈傷蓬松，呈乳白色。
[0057]實施例2
[0058]誘導愈傷培養基中酪蛋白水解物的組分為0.4g/L。其余過程同實施例1。
[0059]實施例3
[0060]在培養基的制備過程中，維生素母液在步驟I)中不進行滅菌，只在步驟2)中進行高溫滅菌。其余過程同實施例1。
[0061]實施例4
[0062]誘導愈傷培養基中不添加酪蛋白水解物，維生素母液在步驟I)中不采用高溫滅菌替代抽濾滅菌。其余過程同實施例1。
[0063]實驗例I
[0064]表1、實施例1-4對愈傷誘導及生長的影響。
[0065]
【權利要求】
1.一種玉米幼胚高效誘導繼代培養基，其特征在于，由包括維生素母液1.5mL、誘導愈傷培養基IL和硝酸銀溶液100 μ L制備而成， 所述誘導愈傷培養基由包括下述組分的原料制備而成:Ν6培養基粉末3.99g/L，2，4- 二氯苯氧乙酸0.002-0.004g/L，脯氨酸2.5-3.5g/L，酪蛋白水解物0.1-0.2g/L，肌醇0.1-0.3g/L,鹿糖 30-40g/L,嗎啉乙磺酸 0.5g/L。
2.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，由包括維生素母液1.5mL、誘導愈傷培養基IL和硝酸銀溶液100 μ L制備而成， 所述誘導愈傷培養基由包括下述組分的原料制備而成:Ν6培養基粉末3.99g/L，2，4- 二氯苯氧乙酸0.003g/L,脯氨酸2.8g/L，酪蛋白水解物0.2g/L，肌醇0.lg/L，蔗糖35g/L,嗎啉乙磺酸0.5g/L。
3.根據權利要求1或2所述的培養基，其特征在于，所述維生素母液由包括下述組分的原料制備而成:維生素B1.6g/L、維生素B60.6g/L、煙酸0.5g/L、泛酸0.5g/L。
4.根據權利要求1或2所述的培養基，其特征在于，所述硝酸銀溶液的濃度為50mM。
5.如權利要求1-4任一所述培養基的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將維生素母液、硝酸銀溶液滅菌，-20°C保存備用； 2)將誘導愈傷培養基原料溶解，定容至1L，調PH值至5.8，加入植物凝膠，將誘導愈傷培養基進行高溫滅菌； 3)誘導愈傷培養基冷卻至50°C時，加入維生素母液、硝酸銀溶液，制得誘導繼代培養基。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中植物凝膠的加入量為2_4g/L。
7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述滅菌為抽濾滅菌或高溫滅菌。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述滅菌為抽濾滅菌。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中所述高溫滅菌的溫度為121°C，滅菌時間為30min。
10.如權利要求1-4任一所述培養基應用于玉米愈傷組織的誘導和繼代培養。
【文檔編號】C05G3/00GK104130058SQ201410356552
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月24日 優先權日:2014年7月24日
【發明者】宋新元, 王大銘, 劉金文, 劉娜, 龍麗坤, 武奉慈 申請人:吉林省農業科學院