專利名稱：一種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及植物組織的再生方法，具體涉及ー種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕再生的方法。
背景技術：
烏桕(Sapium sebiferum)是大戟科烏桕屬落葉喬木,是ー種廣泛分布,集觀形、觀葉、觀果于一體，具有極高觀賞價值的景觀樹種；其種子既含液體油又含固體脂，含油率為42%_53%，為重要的エ業木本油料植物；種子黑色圓形，外被白色蠟質假種殼，可制油漆，假種殼為制蠟燭和肥皂的原料，烏桕種殼表面白色的蠟層可以榨取固體的油脂叫桕脂或殼油；黑色的種殼內是種仁，可以榨取液體油稱為桕油或梓油；烏桕還具有廣泛的藥用價值， 以根皮、樹皮、葉入藥，具有殺蟲，解毒，利尿，通便的功效。目前已有1400多年的栽培歷史，是我國特有的重要經濟樹種。目前生產上，烏桕以播種繁殖為主，然而烏桕種子具有明顯的休眠習性，且種子外被蠟質，影響種子的吸水、發芽，播種前需進行脫蠟處理，這給烏桕的播種繁殖帶來了很多不便；且出苗后還需移栽，過程繁瑣，費時費力，且播種受時間的限制；目前有關烏桕直接誘導叢生芽和間接通過愈傷組織再生的快繁體系已有報道，一方面促進了烏桕的快繁和轉化研究，但另一方面存在著再生過程繁瑣，且通過叢生芽再生途徑過程中嵌合體較多，愈傷組織再生植株存在著細胞無性系變異較大，遺傳性狀不穩定等問題。植物胚狀體是指在離體培養條件下，沒有經過受精過程，但是經過了胚胎發育過程所形成胚狀類似物。幼胚胚狀體再生途徑所形成的胚狀體具有雙極性，胚的結構完整，數量大，繁殖率高，再生植株速度快；由于胚狀體形成時與母本的維管束系統聯系較少，可獲得無病毒植株；同時再生植株遺傳性狀穩定，無性系變異小、轉化獲得的轉基因植株嵌合體少，并且可保持較長時期的胚胎發生能力等，為植物倍性育種、突變體選育、細胞工程和基因工程等研究奠定了基礎，也是研究烏桕胚胎早期形態建成和調控的理想模型。而關于通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，目前尚未有報道。因此，急需開發一種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，以滿足當前烏桕種苗快速繁殖和品種改良的需要。
發明內容
為解決上述問題，本發明運用生物技術手段，提供一種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，從而建立一種高效快速、遺傳性狀穩定的烏桕植株再生方法。為了實現上述目的本發明采用如下技術方案
一種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，其特征在干首先取烏桕未成熟種子，剝去綠色果殼后，在無菌操作臺內進行表面消毒；然后剪開種殼取出帶胚乳的未成熟合子胚，進行部分損傷后，接種于胚狀體誘導培養基中，經過2個月左右黑暗培養，獲得兩種經不同發育途徑產生的胚狀體；將它們接種在相應的誘導培養基中進行繼代和増殖培養；然后在成苗培養基上誘導成苗；培養20-30d左右，至幼苗長成2-4個葉片，進行煉苗并移栽，獲得健壯的烏桕再生苗。所述的烏桕未成熟種子取材于7月中旬即授粉ー個半月左右。所述的烏桕未成熟種子表面消毒是指用75%的こ醇表面消毒2_3min，無菌水沖洗2遍,之后用0.1 %的升萊消毒5-7min,最后用無菌水沖洗5遍,消毒期間不停地搖動。所述的帶有胚乳的未成熟合子胚在接種過程中用鑷子對幼胚進行部分損傷。所述的胚狀體誘導培養基為MS+ 0. 1-2. Omg/L 2，4-D或0. 1-2. Omg/L IAA或0. 2-2. Omg/L NAA +30g/L蔗糖+7. 5g/L瓊脂，pH=5. 8-6. 0 ;所述的繼代和增殖培養基為相應的誘導培養基。所述的胚狀體成苗培養基為1/2MS+ 30g/L蔗 糖+7. 5g/L瓊脂，pH=5. 8-6. O。所述的胚狀體誘導條件為溫度(25±2)°C，黑暗培養。
本發明有益效果在于1、本發明所提供的通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，由于其能真實反映植株果實特性，遺傳性狀穩定，且胚狀體結構完整、數量大、繁殖系數高(每個胚可以產生數十個甚至更多的苗)等，為烏桕優良植株的快繁和遺傳改良提供了重要的技術支持；同時，在一定程度上緩解了烏桕傳統育種過程中費時費力的問題，也避免了通過器官發生和間接愈傷組織再生途徑對烏桕進行繁殖和遺傳改良方面所帯來的嵌合體多、遺傳性狀不穩定等問題。
圖1為取材時期的烏桕果實。圖2為胚狀體發育的一種途徑(發育過程從a到f)。圖3為胚狀體發育的第二種途徑(發育過程從a到f)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進ー步詳細說明。
實施例一種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法具體操作如下1、于7月中旬即授粉ー個半月左右采集烏桕未成熟種子。2.剝去綠色果殼后，種子用75%的こ醇表面消毒2-3min,無菌水沖洗2遍，之后用0.1 %的升汞消毒5-7min，最后用無菌水沖洗5遍,消毒期間不停的搖動。3、取出帶有胚乳的未成熟胚，進行部分損傷后放在胚狀體誘導培養基上進行誘導，經過約2個月左右的黑暗培養獲得兩種不同形態的胚狀體(圖2、3 )，誘導率可達90%左右。胚狀體誘導培養基為 MS+ 0. 1-2. Omg/L 2，4-D 或 0. 1-2. Omg/L IAA 或 0. 2-2. Omg/L NAA +30g/L 蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂，pH=5. 8-6. O。4、將繼代和増殖培養后獲得的胚狀體接種于胚狀體成苗培養基進行成苗培養。胚狀體成苗培養基為1/2MS+ 30g/L蔗糖+7. 5g/L瓊脂，pH=5. 8-6. O。最后開蓋煉苗、移栽，獲得健壯的烏桕再生植株。
權利要求
1.一種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，其特征在于首先取烏桕未成熟種子，剝去果殼后，在無菌操作臺內進行表面消毒；然后剪開種殼取出未成熟合子胚，用鑷子進行部分損傷后，接種于胚狀體誘導培養基中，經過2個月左右黑暗培養，獲得2種經不同發育途徑產生的胚狀體；將兩種胚狀體接種在相應的誘導培養基中進行繼代和增殖培養；然后轉至成苗培養基上誘導成苗；培養20-30d左右，待幼苗長成2-4片葉子時，進行煉苗移栽，獲得健壯的烏桕再生苗。
2.根據權利要求1所述的通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，其特征在于所述的烏桕未成熟種子取材于7月中旬即授粉一個半月左右。
3.根據權利要求1所述的通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，其特征在于所述的烏桕未成熟種子表面消毒是指用75%的乙醇表面消毒3min，無菌水沖洗2遍，之后用O.1 %的升萊消毒7min,最后用無菌水沖洗5遍,消毒期間不停地搖動。
4.根據權利要求1所述的通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，其特征在于所述的帶有胚乳的未成熟合子胚在接種過程中用鑷子對幼胚進行部分損傷。
5.根據權利要求1所述的通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，其特征在于所述的胚狀體誘導培養基為MS+ O. 1-2. Omg/L 2，4-D或O. 1-2. Omg/L IAA或O.2-2. Omg/L NAA +30g/L蔗糖+7. 5g/L瓊脂，pH=5. 8-6. 0 ;所述的繼代和增殖培養基為相應的誘導培養基。
6.根據權利要求1所述的通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，其特征在于所述的胚狀體成苗培養基為1/2MS+ 30g/L蔗糖+7. 5g/L瓊脂，pH=5. 8-6. O。
7.根據權利要求1所述的通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，其特征在于所述的胚狀體誘導條件為溫度(25±2) V，黑暗培養。
全文摘要
本發明公開了一種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，此方法繁殖速度快，繁殖系數高(每個胚可以產生數十個甚至更多的苗)；同時又能真實反映植株果實特性且遺傳性狀穩定，為成熟烏桕優良植株的快繁和遺傳改良提供了重要的技術支持；同時，在一定程度上緩解了烏桕傳統育種過程中費時費力的問題，也避免了通過器官發生和間接愈傷組織再生途徑對烏桕進行繁殖和遺傳改良方面所帶來的嵌合體多、遺傳性狀不穩定等問題。
文檔編號A01H4/00GK103004594SQ20121054117
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者吳麗芳, 侯金艷, 李明浩 申請人:中國科學院合肥物質科學研究院