專利名稱：真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法
技術領域：
本發明屬海洋生物技術領域，通過真鯛胚胎玻璃化冷凍、液氮長期保存及解凍洗脫等技術獲取正常復活胚胎。
背景技術：
魚類胚胎冷凍保存研究約有20年歷史。國內外學者對魚類胚胎冷凍保存的損傷機理、冷凍降溫速率、解凍復溫、抗凍劑種類和毒性等方面進行了大量研究，并取得很大進展。目前鯉科魚類胚胎在-100℃以上溫度的冷凍保存已獲得較穩定的復活率(張克儉等。三種淡水魚類胚胎低溫保存及其降溫和復溫速率的研究。水產學報1997，21(4)366-372)，鮭鱒魚類胚胎亦突破-25℃的界限(Erdahl，D.A.，Preservation of spermatozoa and ova from freshwater fish.Thesis of the Universityof Minnesota1986)。鯉魚(Zhang，X.S.，et al.A study on the cryopreservation of commoncarp embryos.Cryo Letters，1989，10271-278)、泥鰍(張克儉等，同上)在液氮區獲得了個別冷凍復活胚胎，盡管以上實驗還難以重復，但可以說是目前比較好的結果。由于魚類胚胎尤其是海水魚類胚胎體積大、含有大量的卵黃和水分等特點，給胚胎冷凍保存造成很大困難。玻璃化冷凍方法是近年來興起的一種生物材料保存的新方法，以其凍存體積小、表面積大、操作方便快捷、設備要求簡單等特點而表現了良好的應用前景。真鯛的胚胎冷凍保存對真鯛這種海水名貴魚類的種質保存、遺傳多樣性保護和育種及其養殖業可持續發展具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在于提供真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法。
為實現上述目的，本發明采取的技術方案為一種真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法，選擇真鯛心跳期至出膜前期胚胎，將其放入抗凍劑中后，在冰箱中預冷，利用麥管快速玻璃化方法直接投入液氮中保存，解凍時放入43℃快速水浴解凍，用洗脫溶液洗脫，最后放入海水中培育，獲取復活胚胎。
選擇真鯛心跳期至出膜前期胚胎時，真鯛胚胎心跳次數為60-140次/分鐘。
抗凍劑以平衡鹽溶液Cortland為基液，溶液中含有二甲基亞砜體積含量20.5％(V/V)+乙酰胺體積含量15.5％(V/V)+丙二醇體積含量10％(V/V)+聚乙二醇(PEG8000)質量體積比6％(W/V)多種抗凍劑混合使用。
真鯛胚胎在冰箱中預冷時，溫度為0～4℃，預冷時間20～25分鐘。
使用冷凍容器時，冷凍容器為麥管，體積0.4～0.6ml。
投入液氮保存時，加入輔助設施支撐鋁條、鐵球，麥管快速浸入液氮中。
水浴解凍時，在43℃水浴，快速解凍3～5秒。
洗脫時，在0.5mol/L蔗糖中浸泡9～11分鐘。
本發明的優點在于1、真鯛心跳期胚胎與其它早期階段的胚胎相比，對冷凍降溫的耐受力最強；2、二甲基亞砜、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇多種滲透性抗凍劑和非滲透性抗凍劑混合使用，降低了玻璃化液濃度，從而減輕了對胚胎的毒性，同時提高玻璃化程度；3、麥管體積小，導熱性好，易于實現玻璃化；4、快速玻璃化，避免了冰晶形成對胚胎的冷凍損傷；5、冷凍、解凍操作簡便，克服大型儀器設備制約，益于廣泛推廣；本發明對真鯛心跳期胚胎，通過添加抗凍劑，采用快速麥管玻璃化冷凍、液氮保存、解凍、洗脫等步驟，獲得復活胚胎。本發明真鯛胚胎冷凍保存對于真鯛的種質保存、遺傳多樣性和育種及可持續養殖等方面有著重要意義。
具體實施例方式
本發明的保護范圍不僅局限于下列實施例中。
(1)撈取同批自然產真鯛受精卵，放置海水溫度18±1℃、微充氣的孵化桶內培育，至心跳期胚胎，心跳次數60次/分鐘以上(60-140次/分鐘)；(2)用80目篩絹網撈取胚胎，用濾紙輕蘸吸去表面海水，放入抗凍劑中，抗凍劑為多種抗凍劑混合使用，含二甲基亞砜20.5％(體積含量)+乙酰胺15.5％(體積含量)+丙二醇10％(體積含量)+聚乙二醇6％(質量體積比，W/V，每100ml溶液中含6g聚乙二醇)，平衡鹽溶液Cortland作為基液(即余量，pH＝8.28)，并快速吸入0.5ml麥管中，在0～4℃冰箱中預冷25分鐘。
(3)將支撐鋁條底部固定一直徑約1.5cm的鐵球，用來加快浸入液氮的速度。
(4)從冰箱中取2支麥管(共有胚胎96粒)，取出事先浸入液氮的支撐鋁條，將麥管卡緊在支撐條上，快速投入液氮中。
(5)4小時后取出麥管，迅速放入43℃水浴鍋中解凍，3～5秒鐘后取出。
(6)剪斷麥管兩端，將內容物倒入80目篩絹的小漏斗上，過濾胚胎，與抗凍劑分離；
(7)將胚胎放入0.5mol/L蔗糖溶液中浸泡10分鐘，然后再過濾，放入18±1℃的過濾海水中靜水培育；(8)解凍后復活胚胎共2粒，復活率為2.1％，復活胚胎全部發育至仔魚。
另外，經試驗，真鯛胚胎在冰箱中預冷時，溫度為0～4℃，預冷時間可以為20～25分鐘；麥管體積可以為0.4～0.6ml；洗脫時，在0.5mol/L蔗糖中浸泡時間可以為9～11分鐘，亦可達到本發明目的，由于其實施較為簡單，故不再贅述。
權利要求
1.一種真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法，其特征在于選擇真鯛心跳期至出膜前期胚胎，將其放入抗凍劑中后，在冰箱中預冷，利用麥管快速玻璃化方法直接投入液氮中保存，解凍時放入43℃快速水浴解凍，用洗脫溶液洗脫，最后放入海水中培育，獲取復活胚胎。
2.根據權利要求1所述真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法，其特征在于選擇真鯛心跳期至出膜前期胚胎時，真鯛胚胎心跳次數為60-140次/分鐘。
3.根據權利要求1所述真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法，其特征在于所述抗凍劑以平衡鹽溶液Cortland為基液，溶液中含有二甲基亞砜體積含量20.5％(V/V)+乙酰胺體積含量15.5％(V/V)+丙二醇體積含量10％(V/V)+聚乙二醇質量體積比6％(W/V)。
4.根據權利要求1所述真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法，其特征在于真鯛胚胎在冰箱中預冷時，溫度為0～4℃，預冷時間20～25分鐘。
5.根據權利要求1所述真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法，其特征在于使用冷凍容器時，冷凍容器為麥管，體積0.4～0.6ml。
6.根據權利要求1所述真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法，其特征在于投入液氮保存時，加入輔助設施支撐鋁條、鐵球，麥管快速浸入液氮中。
7.根據權利要求1所述真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法，其特征在于水浴解凍時，在43℃水浴，快速解凍3～5秒。
8.根據權利要求1所述真鯛麥管玻璃化冷凍保存方法，其特征在于洗脫時，在0.5mol/L蔗糖中浸泡9～11分鐘。
全文摘要
本發明屬海洋生物技術領域，通過真鯛胚胎玻璃化冷凍、液氮長期保存及解凍洗脫等技術獲取正常復活胚胎。本發明對真鯛心跳期胚胎，通過添加抗凍劑，采用快速麥管玻璃化冷凍、液氮保存、解凍、洗脫等步驟，獲得復活胚胎。真鯛胚胎冷凍保存對于真鯛的種質保存、遺傳多樣性和育種及可持續養殖等方面有著重要意義。
文檔編號C12N5/08GK1749392SQ20041005041
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月15日 優先權日2004年9月15日
發明者丁福紅, 李軍, 肖志忠 申請人:中國科學院海洋研究所