專利名稱：一種水稻愈傷組織特異性啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種水稻愈傷組織特異性啟動子及其應用。
背景技術：
篩選標記基因作為一種有效的手段用于植物遺傳轉化后的陽性轉化子的篩選，但目前介導標記基因表達均采用組成性啟動子，其中在植物遺傳轉化最為廣泛地是煙草花葉病毒的CaMV35S啟動子(徐春波、王勇、李興酉、趙海霞，兩種啟動子調控下的 CBF4基因植物表達載體的構建，生物技術，2010)，其次是WDiquitin啟動子(Garbarino， J. Ε.，Τ. Oosumi, and W. R. Belknap, Isolation of a polyubiquitin promoter and its expression in transgenic potato plants. Plant Physiol，1995)，這些啟動子雖然在植物遺傳轉化得到了廣泛應用，但由于是組成性表達，在轉基因的生物安全性存在標記基因的安全性的擔憂，為了克服現有廣泛采用的啟動子外源性和組成性表達的缺點，我們試圖從水稻基因組內克隆具有愈傷組織特異性表達的啟動子，不僅能有效地解決組成表達啟動子介導標記基因存在的安全擔憂，還能解決外源DNA序列的問題，同時可打破使用國外的組成性啟動子在我國轉基因研究的知識產權壁壘。在植物轉基因研究中，標記基因的表達量大小對篩選效果至關重要，目前應用于植物轉基因的選擇標記基因主要有兩大類一類是編碼抗生素抗性的基因，新霉素磷酸轉移酶基因II (nptH)、潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)和二氫葉酸還原酶基因(dhfr)等； 另一類是編碼除草劑抗性的基因，例如，草丁膦乙酰轉移酶基因(bar)、5_烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶基因(epsps)等。從水稻轉基因的篩選來看，以潮霉素磷酸轉移酶基因 (hpt)篩選效果最好，草丁膦乙酰轉移酶基因(bar)次之，其他標記基因在水稻上的利用較差，而提高標記基因的表達量可以提高的選擇效率，而提高基因表達可以從轉錄水平和轉錄后水平以及翻譯水平入手，從提高轉錄水平主要是選用較強的啟動子，在轉錄后或翻譯水平主要是增加翻譯效率。由于目前使用的選擇性標記基因都來自于真菌，由于遺傳密碼存在簡并性，各物種之間對密碼子使用頻率上存在較大差異，椐文獻報道，外源基因經密碼子優化后的基因表達量提高 100 1000倍(Mason，H. S.，et al. ,Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin(LT) -potatoes expressing a synthetic LT-B gene. Vaccine，1998)，因此根據物種不同對選擇性標記基因進行密碼子優化，可以提高選擇標記基因的表達，從而可以達到提高選擇效應的目的。由于密碼子的數量(64)比氨基酸的數量00)多，所以大多數的氨基酸都有超過一個密碼子編碼。編碼相同或相近氨基酸的密碼子在序列上往往相似，四個編碼同一種氨基酸的密碼子只在第三位上不同，有時這一位點上的不同會是嘌呤和嘧啶之間的不同造成的。密碼子最后一位堿基專一性降低的現象稱為第三位堿基的簡并性。密碼子的翻譯需要與相應的氨酰-tRNA上的反密碼子配對。雖然，一種tRNA經常能識別超過一種的密碼子， 但是不同的tRNA使用頻率是不同的。不同物種對使用密碼子的偏愛性不同，各物種在密碼子第一和第二位堿基的使用率變化不大，但是在第三位堿基上表示出極大差異，具有偏愛性。如果在植物轉化時使用植物偏愛密碼子，可以提高tRNA的識別效率，從而提高翻譯效率。因此，在不改變氨基酸序列的前提下，根據水稻密碼子的偏愛性對hpt基因的密碼子進行優化，使其核苷酸序列100%的使用水稻偏愛的密碼子，然后將其克隆至OsCSP啟動子的下游，構建了用于與表達載體共轉化的載體。并且將整個表達元件(包括啟動子，篩選基因，終止子)都克隆到了載體的T-border之間，構建了可用于農桿菌轉化的載體。本研究水稻的半胱氨酸蛋白酶基因克隆了一個愈傷組織特異性(Rice Callus-Specific Promoter，，簡稱OsCSP)啟動子，并用于介導篩選性標記基因表達，通過對篩選性標記基因hpt基因的密碼子優化，明顯地提高了 OsCSP在水稻轉基因選擇的轉化效率，在轉化效率、假陽性率、共轉化率均達到了 pCambia的WDiquitin啟動子介導標記基因的效果，建立了以水稻單子葉作物的利用OsCSP啟動子介導潮霉素磷酸轉移酶基因 (hpt)的水稻或單子葉作物的遺傳轉化的篩選標記體系，為建立轉基因作物的轉基因生物安全性提供了一個新的途徑和方法。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種水稻愈傷組織特異性表達的啟動子，即半胱氨酸蛋白酶基因的啟動子-OsCSP啟動子，提高了在轉基因作物的篩選標記基因的生物安全性。本發明的另一個目的是提供含有所述OsCSP啟動子的植物表達載體。本發明的再一個目的是提供含有所述OsCSP啟動子序列的轉化體。本發明的另一個目的是提供所述OsCSP啟動子與密碼子優化后的潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)融合在轉基因水稻篩選中的應用。根據本發明的一個方面，從水稻種子中克隆了半胱氨酸蛋白酶(OsCSP)啟動子， 其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，在一種實施方式中顯示本發明的OsCSP啟動具有愈傷組織特異性，為轉基因作物的篩選標記基因的安全性提供了新的方法。根據本發明的第二方面，所述植物表達載體是采用基因工程方法，將OsCSP啟動子插入到適宜的表達載體中而獲得。優選的是在所述表達載體中包含潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt基因)作為篩選基因，更優選地，根據水稻密碼子的偏愛性對hpt基因的密碼子進行優化，使其核苷酸序列100%的使用水稻偏愛的密碼子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，然后將其克隆至OsCSP啟動子的下游，構建了用于與表達載體共轉化的載體，使其在陽性轉基因的篩選效果達到或優于現有國際上等同載體在水稻轉基因篩選中的作用。在一種實施方式中，構建了 p0sPMP522植物表達載體，其具有如圖2所示的結構。根據本發明的第三方面，將上述植物表達載體轉化適宜的宿主即可高效地獲得本發明的轉化體。在一種實施方式中，采用共轉化法將含有OsCSP啟動子的植物表達載體 p0sPMP522轉化到農桿菌菌株EHA105中獲得了與國際上采用外源的啟動子介導篩選標記基因的水稻轉化體。根據本發明的第四方面，通過將篩選標記基因克隆至位于本發明所述水稻愈傷組織特異性啟動子的下游，構建含有所述水稻愈傷組織特異性啟動子、篩選標記基因和目標基因的植物表達載體；利用該植物表達載體用于水稻農桿菌轉化愈傷組織；利用篩選標記基因對愈傷組織進行篩選，而在愈傷組織除外的以后的發育階段的各組織沒有表達，從而提高了在谷物作物中利用選擇性標記基因進行轉基因篩選的生物安全性。本發明提供了一種水稻愈傷組織特異性啟動子-OsCSP啟動子，該啟動子在水稻愈傷組織中特異性表達，可通過該啟動子控制篩選標記標記基因在正常水稻植株中的表達來對轉基因水稻進行篩選。同時結合對篩選標記基因的密碼子優化，不僅由于篩選標記基因的表達主要在愈傷組織階段進行，而且提高了篩選標記基因在愈傷組織的表達，提高了陽性轉基因的篩選效率，克服了因使用內源或外源的組成性表達啟動子減少外源遺傳物質導入水稻基因組的風險，同時使篩選標記基因的表達限定在愈傷組織，提高篩選標記基因對轉基因水稻的生物安全性，同時減少公眾對轉基因中的篩選標記基因的安全擔憂。
圖1 :0sCSP啟動子擴增中的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜；圖2 植物表達載體p0sPMP522的結構示意圖；圖3 =OsCSP啟動子的組織特異性表達⑶S染色結果；其中1為非轉基因愈傷組織； 2、3、4、5分別為p0sPMP43轉基因抗性愈傷、葉、根、種子。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明進行進一步的詳細說明，但以下描述并不對本發明進行限定，任何對本發明的變形和改變，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范圍。材料試劑植物材料為水稻粳稻(Oryza sativa. subsp. japonica)品種 TP309。大腸桿菌菌株為DH10B，購自hvitrogen公司；農桿菌菌株為EHA105，購自hvitrogen公司；載體pCAMBIA1300，pCAMBIA1301，購自 hvitrogen 公司，pBI221，pUC57，購自南京金斯瑞生物科技有限公司；p0sPMP05，p0sPMP122, p0sPMP209, p0sPMP522, p0sPMP43 為本發明構建的載體。載體構建過程中所用限制性內切酶，購自NEB和!^ermentas公司；Taq酶、T4DNA Ligase購自美國hvitrogen公司；凝膠回收試劑盒購自X-gene ；所用化學試劑除特殊說明外均為分析純，購自上海國藥。實施例1水稻愈傷組織特異性啟動子(OsCSP)的克隆1、提取水稻TP309基因組DNAA)取0. 1克幼葉置于研缽中，加入0. 6ml CTAB提取液，將葉片研磨均勻；B)在65°C水浴鍋中溫浴30min，其間溫和搖蕩2 3次，溫浴后取出自然冷卻至室C)加入0. 6ml抽提液(氯仿異戊醇=24 1)后輕搖5分鐘，離心(IOOOOrpm) 5 分鐘；D)吸取上清置于另一個1. 5ml離心管，加入75 μ L的3Μ醋酸鈉和Iml的預冷無水乙醇；Ε)在室溫下離心(12000rpm) 10分鐘，棄去上清，加入Iml 70%乙醇，離心洗滌沉淀，倒掉乙醇，干燥DNA;F)待DNA充分干燥后，加200 μ 1無菌ddH20溶解DNA，4°C備用。2、從半胱氨酸蛋白酶基因序列(Genbank登錄號為AL732346)擴增愈傷組織特異性啟動子(OsCSP)以水稻TP309基因組DNA為模板，設計克隆OsCSP啟動子所需的引物(兩端帶有 HindIII和NaeI的酶切位點)正向引物5，-cgccaagcttGCATGCCTGCAGCCA-3，(SEQID NO. 4)反向引物5，-ccatgccggcGACGTGGAGACGAGC-3，(SEQ ID NO. 5)利用上述引物進行PCR反應，從水稻基因組中擴增OsCSP啟動子。擴增體系擴增程序:94°C5min，94°C 30s，58°C 30s,68°C lmin，35 個循環，68°C延伸 lOmin， 25°C保存。反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，回收目的條帶(圖1)。將回收片段送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序結果表明OsCSP啟動子具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，由1111個堿基組成，與網上公布的序列一致。實施例2構建含有OsCSP啟動子的載體1、OsCSP-stuff-nos 載體的構建用Hindlll/Nael分別雙酶切OsCSP啟動子的擴增片段回收產物和pBI221質粒。 沉淀回收酶切后的啟動子，插入到酶切后回收的4. Skb的pBI221載體，轉化DH10B后篩選正確的轉化子。所得載體OsCSP-stuff-nos編號為p0sPMP209。2、OsCSP-gus-nos 載體的構建以 pCAMBIA1301 為模版，擴增 GUS 基因。正向引物為 5，_cggtgccggcATGGTAGATCTG AGGG-3，(SEQ ID NO. 6)，反向引物為 5’-ccgctcgagTCACACGTGGT GGTG-3，(SEQ ID NO. 7), 擴增溫度60°C。用NaeIAhoI消化PCR凝膠回收產物，酶切產物沉淀回收，插入到經NaeI/ XhoI雙酶切的p0sPMP209質粒，轉化DH10B后篩選正確的轉化子。所得載體OsCSP-gus-nos 編號為p0sPMP43。3、JH-0sCSP-hpt-nos 載體的構建以 pCAMBIA1301 為模版，擴增 hpt 基因。正向引物5，-aaaagtactATGAAAAAGCCTG
權利要求
1.一種水稻愈傷組織特異性啟動子，其具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述的啟動子的表達載體。
3.權利要求2所述的表達載體，其包含水稻密碼子優化的潮霉素磷酸轉移酶基因。
4.權利要求3所述的表達載體，其中所述的水稻密碼子優化的潮霉素磷酸轉移酶基因具有如SEQ ID NO. 2所示的序列。
5.如權利要求2-4任一項所述的表達載體，其具有如圖2所示的結構。
6.如權利要求5所述的表達載體，其具有如SEQID NO. 3所示的序列
7.由權利要求2-6任一項所述的表達載體轉化宿主獲得的轉化體。
8.權利要求1所述的啟動子或權利要求2所述的表達載體在制備轉基因植物中的應
全文摘要
本發明提供了一個從水稻中克隆的愈傷組織特異性啟動子，含有該啟動子與經水稻密碼子優化的篩選標記基因的表達載體及轉化體。該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其具有愈傷組織表達特異性，在愈傷組織中有較高的活性。通過該啟動子控制經密碼子優化的篩選標記基因(序列如SEQ ID No.2所示的潮霉素磷酸轉移酶基因)在正常水稻植株中表達，可以高效地篩選轉基因水稻，可徹底解決篩選標記基因對生物環境安全問題，提高了轉基因水稻的生物安全性，同時增加了選擇效率。
文檔編號A01H5/00GK102181444SQ201110054109
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月7日 優先權日2011年3月7日
發明者寧婷婷, 楊代常, 汪相宏 申請人:武漢禾元生物科技有限公司