專利名稱：一種從紫花苜蓿干草中制備純多糖的方法
技術領域：
本發明屬于一種植物活性成分的提取方法，具體地涉及一種從紫花苜蓿干草中制備純多糖的方法。
背景技術：
苜蓿多糖(Alfalfa Polysaccharides,^)是從紫花苜蓿中提取的植物多糖，包括 AP I、AP IKAP IILAP IV 4個組分，是具有特殊生物活性的多糖。目前已證明苜蓿多糖在一定劑量范圍內對畜禽有明顯的促生長作用，具有增強免疫功能和抗感染作用，還有治療高膽固醇的作用，且可強化血管和防止動脈硬化、血栓癥、降血糖、抗輻射和心肌梗等。苜蓿多糖是無毒性的，而且有著很顯著的保健效果，近年來它作為一種新型的保健食品和飼料添加劑而逐漸受到人們的重視。紫花苜蓿作為一種多年生優質豆科牧草，在世界各國廣泛栽培，資源豐富，為苜蓿多糖的生產提供了充足且廉價的原料。而苜蓿多糖的提取方法尚不完善，純化技術也未經探討，傳統的提取方法通常要將草粉在沸水中連續煮池左右，耗費能源與時間，生產效率低，且純度沒有保障。為了使其能更適應工業化生產，提取工藝則有待于改善。
發明內容
本發明的目的是提供一種從紫花苜蓿中提取和純化分離苜蓿多糖的方法，利用超聲波的輔助作用，大幅減少苜蓿多糖的浸提時間，提高提取效率。降低提取時所用溫度，節約能源的投入。采用成本低廉的水作為溶劑，所用提取劑無毒無污染，可回收。提高多糖得率，操作簡便易行，適合于大規模生產。本發明提供的技術方案，其特征在于包括以下工藝步驟
1、將風干或烘干的苜蓿草粉碎，過60目篩，加入20-35倍于草粉重量20-40°C的溫水浸泡 30min ；
2、置于超聲波提取器中，將溫度升高到70-80°C，以后保持恒溫，開啟超聲波，于400W 功率下，以60kHz超聲波作用20-30min，在此期間邊加熱邊攪拌。作用后以真空泵抽濾，收集濾液，得多糖提取液；
3、將提取液用旋轉蒸發器在70-90°C下濃縮至原體積的1/3，然后與等體積的正丁醇-三氯甲烷溶液混合，于分液漏斗中劇烈震蕩后靜置30min，棄去下層液體，依據本步驟反復操作3次得純化的多糖溶液；
4、于上述所得多糖溶液中加入3-4倍體積乙醇，待充分產生沉淀后，3000-4000rpm下離心10-15min，收集下層沉淀；將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥，即得多糖結晶，裝入密封容器中保存備用；
5、使用玻璃層析柱濕法裝填kphadexA_25纖維素凝膠，裝填高度35_45cm，將整個系統用蒸餾水平衡Mh，之后加入前述步驟制得的粗多糖，以蠕動恒流泵過柱，上樣量 50-150mg ；洗脫速度:8-12ml/h ；依次用 0. 05-0. 15mol/L、0. 2-0. 4 mol/L、0. 45-0. 55 mol/L和0. 6-0. 8 mol/L的NaCl溶液洗脫；四個濃度梯度依次收集50ml, 75ml, 75ml, 50ml洗脫液；
6、進一步純化使用4組玻璃層析柱濕法裝填kphadexG-200纖維素凝膠，裝填高度 35-45cm,在加入樣品前，將整個系統用蒸餾水平衡Mh ；4組玻璃層析柱中分別通入上述4 組洗脫液，以蠕動恒流泵過柱，洗脫速度4-8ml/h ；用0. 1-0. 3mol/L的NaCl溶液洗脫；
7、收集各kphadexG-200柱濾液于旋轉蒸發器在70_90°C下濃縮至原體積的1/3，分別加入3-4倍體積乙醇，待充分產生沉淀后，3000-4000rpm下離心10-15min，收集下層沉淀；將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥，即得各組分純多糖結晶。上述方案中所用乙醇濃度為95-100%。為了盡可能充分地收集到多糖產品，在超聲波作用后和抽濾時需用水將所用過的容器洗滌2-3次，在醇析之后需用乙醇將所用容器洗滌2-3次。以上步驟中所用乙醇均可蒸餾回收留作下次使用。本發明是在多次分析和試驗的基礎上，以苜蓿多糖得率為指標，對提取過程中的提取溫度，浸提時間，料液比，萃取次數，醇析用乙醇量，以及各種柱層析條件等因素分別進行分析考察，確定了苜蓿多糖的最佳提取和純化條件，為苜蓿多糖的開發和生產提供依據。本發明的積極效果利用超聲波的輔助作用，大幅減少了苜蓿多糖的浸提時間，提高了提取效率。降低了提取時所用溫度，節約了能源的投入。同時引入了用纖維素柱層析法純化苜蓿多糖的技術，填補了其純品難以制備的空白。本發明采用成本低廉的水作為溶劑，所用提取劑無毒無污染，可回收。提高多糖得率，多糖產品純度可達96%以上。操作簡便易行，適合于大規模生產。有利于苜蓿多糖作為人類保健品和畜禽飼料添加劑應用。
具體實施例方式實施例1
(1)將風干或烘干含水率15%以下的苜蓿草粉碎，過60目篩，加入30倍于草粉重量 30°C的溫水浸泡30min。(2)置于超聲波提取器中，將溫度升高到70°C，以后保持恒溫，開啟超聲波，于 400W功率下，以60kHz超聲波作用20min，在此期間邊加熱邊攪拌。作用后以真空泵抽濾， 收集濾液，得多糖提取液。(3)將提取液用旋轉蒸發器在80°C條件下濃縮至原體積的1/3，然后與等體積的正丁醇-三氯甲烷溶液(正丁醇與三氯甲烷以1 :4體積比混合)混合，于分液漏斗中劇烈震蕩后靜置30min，棄去下層液體，依據本步驟反復操作3次得純化的多糖溶液。(4)于上述所得溶液中加入3倍體積乙醇，乙醇濃度為95-100%，待充分產生沉淀后，3000rpm下離心lOmin，收集下層沉淀。將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥，即得多糖結晶。(5)使用玻璃層析柱(50*1. 6cm)濕法裝填kphadex A-25纖維素凝膠，裝填高度 35 cm，將整個系統用蒸餾水平衡Mh，之后加入前述步驟制得的粗多糖，以蠕動恒流泵過柱，上樣量60mg，洗脫速度8ml/h。依次用 0. Imol/L、0. 3 mol/L,0. 5 mol/L 和 0. 7 mol/ L的NaCl溶液洗脫。四個濃度梯度依次收集50ml，75ml，75ml，50ml洗脫液。(6)進一步純化使用4組玻璃層析柱(50*1. 6cm)濕法裝填kphadex G-200纖維素凝膠，裝填高度35cm，在加入樣品前，將整個系統用蒸餾水平衡Mh。4組玻璃層析柱中分別通入上述4組洗脫液，以蠕動恒流泵過柱，洗脫速度％il/h。用0. lmol/L的NaCl溶液洗脫。(7)收集各kphadex G-200柱濾液于旋轉蒸發器在70_9(TC下濃縮至原體積的1/3，分別加入3倍體積乙醇，乙醇濃度為95-100%，待充分產生沉淀后，3000rpm下離心 IOmin,收集下層沉淀。將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥，即得AP K AP IK AP III、AP IV 4個組分純多糖結晶。將所得各組分用紫外分光光度計于200-400nm波長范圍內掃描，在^0nm、280nm處均無特定吸收峰，表明其中不含蛋白、多肽及核酸類物質。經硫酸-咔唑反應，斐林試劑反應，碘-碘酸鉀反應，雙縮脲反應，三氯化鐵反應鑒定均呈陰性， 表明多糖中不含糖醛酸、還原糖、淀粉、蛋白質和酚類化合物。苯酚-濃硫酸法于490nm波長下鑒定多糖含量均大于96%。實施例2
(1)將風干或烘干含水率15%以下的苜蓿草粉碎，過60目篩，加入35倍于草粉重量 :35°C的溫水浸泡30min。(2)置于超聲波提取器中，將溫度升高到75°C，以后保持恒溫開啟超聲波，于400W 功率下，以60kHz超聲波作用25min，在此期間邊加熱邊攪拌。作用后以真空泵抽濾，收集濾液，得多糖提取液。(3)將提取液用旋轉蒸發器在85°C條件下濃縮至原體積的1/3，然后與等體積的正丁醇-三氯甲烷溶液(正丁醇與三氯甲烷以1 :4體積比混合)混合，于分液漏斗中劇烈震蕩后靜置30min，棄去下層液體，依據本步驟反復操作3次得純化的多糖溶液。(4)于上述所得溶液中加入3. 5倍體積乙醇，乙醇濃度為95-100%，待充分產生沉淀后，4000rpm下離心lOmin，收集下層沉淀。將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥， 即得多糖結晶，裝入密封容器中保存備用。(5)分離純化使用玻璃層析柱(50*1. 6cm)濕法裝填kphadex A-25纖維素凝膠， 裝填高度40cm，在加入樣品前，將整個系統用蒸餾水平衡Mh。以蠕動恒流泵過柱，上樣量 IOOmg,洗脫速度10ml/h。依次用 0. 15mol/L、0. 35 mol/L、0. 55 mol/L 和 0. 75mol/L、的 NaCl溶液洗脫。四個濃度梯度依次收集50ml，75ml，75ml，50ml洗脫液。(6)進一步純化使用4組玻璃層析柱(50*1. 6cm)濕法裝填kphadex G-200纖維素凝膠，裝填高度40cm，在加入樣品前，將整個系統用蒸餾水平衡Mh。4組玻璃層析柱中分別通入上述4組洗脫液，以蠕動恒流泵過柱，洗脫速度6ml/h。用0. lmol/L的NaCl溶液洗脫。(7)收集各kphadex G-200柱濾液于旋轉蒸發器在70_9(TC下濃縮至原體積的 1/3，分別加入3. 5倍體積乙醇，乙醇濃度為95-100%，待充分產生沉淀后，4000rpm下離心 IOmin,收集下層沉淀。將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥，即得AP K AP IK AP III、AP IV 4個組分純多糖結晶。將所得各組分用紫外分光光度計于200-400nm波長范圍內掃描，在^0nm、280nm處均無特定吸收峰，表明其中不含蛋白、多肽及核酸類物質。經硫酸-咔唑反應，斐林試劑反應，碘-碘酸鉀反應，雙縮脲反應，三氯化鐵反應鑒定均呈陰性， 表明多糖中不含糖醛酸、還原糖、淀粉、蛋白質和酚類化合物。苯酚-濃硫酸法于490nm波長下鑒定多糖含量均大于96%。
實施例3
(1)將風干或烘干含水率15%以下的苜蓿草粉碎，過60目篩，加入40倍于草粉重量 40°C的溫水浸泡30min。(2)置于超聲波提取器中，將溫度升高到80°C，以后保持恒溫開啟超聲波，于400W 功率下，以60kHz超聲波作用30min，在此期間邊加熱邊攪拌。作用后以真空泵抽濾，收集濾液，得多糖提取液。(3)將提取液用旋轉蒸發器在90°C下濃縮至原體積的1/3，然后與等體積的正丁醇-三氯甲烷溶液(正丁醇與三氯甲烷以1 :4體積比混合)混合，于分液漏斗中劇烈震蕩后靜置30min，棄去下層液體，依據以上步驟反復操作3次得純化的多糖溶液。(4)于上述所得溶液中加入4倍體積乙醇，乙醇濃度為95-100%，待充分產生沉淀后，于4000rpm下離心lOmin，收集下層沉淀。將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥， 即得多糖結晶。(5)分離純化使用玻璃層析柱(50*1. 6cm)濕法裝填kphadex A_25纖維素凝膠， 裝填高度45cm，在加入樣品前，將整個系統用蒸餾水平衡Mh。以蠕動恒流泵過柱，上樣量 150mg,洗脫速度12ml/h。依次用 0. 05mol/L、0. 25 mol/L、0. 45 mol/L 和 0. 65 mol/L 的 NaCl溶液洗脫。四個濃度梯度依次收集50ml，75ml，75ml，50ml洗脫液。(6)進一步純化使用4組玻璃層析柱(50*1. 6cm)濕法裝填kphadex G-200纖維素凝膠，裝填高度45cm，在加入樣品前，將整個系統用蒸餾水平衡Mh。4組玻璃層析柱中分別通入上述4組洗脫液，以蠕動恒流泵過柱，洗脫速度8ml/h。用0. 2mol/L的NaCl溶液洗脫。(7)收集各kphadex G-200柱濾液于旋轉蒸發器在70_9(TC下濃縮至原體積的1/3，分別加入4倍體積乙醇，乙醇濃度為95-100%，待充分產生沉淀后，4000rpm下離心 IOmin,收集下層沉淀。將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥，即得AP K AP IK AP III、AP IV 4個組分純多糖結晶。將所得各組分用紫外分光光度計于200-400nm波長范圍內掃描，在^0nm、280nm處均無特定吸收峰，表明其中不含蛋白、多肽及核酸類物質。經硫酸-咔唑反應，斐林試劑反應，碘-碘酸鉀反應，雙縮脲反應，三氯化鐵反應鑒定均呈陰性， 表明多糖中不含糖醛酸、還原糖、淀粉、蛋白質和酚類化合物。苯酚-濃硫酸法于490nm波長下鑒定多糖含量均大于96%。
權利要求
1. 一種從紫花苜蓿干草中制備純多糖的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、將風干或烘干的苜蓿草粉碎，過60目篩，加入20-35倍于草粉重量20-40°C的溫水浸泡30min ；(2)、置于超聲波提取器中，將溫度升高到70-80°C，以后保持恒溫，開啟超聲波，于 400W功率下，以60kHz超聲波作用20-30min，在此期間邊加熱邊攪拌；作用后以真空泵抽濾，收集濾液，得多糖提取液；(3)、將提取液用旋轉蒸發器在70-90°C下濃縮至原體積的1/3，然后與等體積的正丁醇-三氯甲烷溶液混合，于分液漏斗中劇烈震蕩后靜置30min，棄去下層液體，依據本步驟反復操作3次得純化的多糖溶液；(4)、于上述所得多糖溶液中加入3-4倍體積乙醇，待充分產生沉淀后，3000-4000rpm 下離心10-15min，收集下層沉淀；將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥，即得多糖結晶，裝入密封容器中保存備用；(5)、使用玻璃層析柱濕法裝填kphadexA_25纖維素凝膠，裝填高度35_45cm，將整個系統用蒸餾水平衡Mh，之后加入前述步驟制得的粗多糖，以蠕動恒流泵過柱，上樣量 50-150mg ；洗脫速度:8-12ml/h ；依次用 0. 05-0. 15mol/L、0. 2-0. 4 mol/L、0. 45-0. 55 mol/ L和0. 6-0. 8 mol/L的NaCl溶液洗脫；四個濃度梯度依次收集50ml, 75ml, 75ml, 50ml洗脫液；(6)、進一步純化使用4組玻璃層析柱濕法裝填kphadexG-200纖維素凝膠，裝填高度 35-45cm，在加入樣品前，將整個系統用蒸餾水平衡24h ；4組玻璃層析柱中分別通入上述4 組洗脫液，以蠕動恒流泵過柱，洗脫速度4-8ml/h ；用0. 1-0. 3mol/L的NaCl溶液洗脫；(7)、收集各kphadexG-200柱濾液于旋轉蒸發器在70_90°C下濃縮至原體積的1/3， 分別加入3-4倍體積乙醇，待充分產生沉淀后，3000-4000rpm下離心10-15min，收集下層沉淀；將沉淀物以-7(T-60°C于凍干機中冷凍干燥，即得各組分純多糖結晶。
全文摘要
本發明涉及一種從紫花苜蓿干草中制備純化多糖的方法，提供一種能規模化生產，工藝簡單，成本低，效率高的制備苜蓿純多糖的方法。將風干或烘干的苜蓿草粉碎，加入一定量的水浸泡，料水比為120-1:45，在240-400W功率40-60kHz的超聲波作用下以55-85℃加熱10-35min，過濾收集濾液。將得到的濾液濃縮至1/3體積，用按體積比14混合的正丁醇-三氯甲烷溶液除去蛋白，再加入2-4.5倍于原液的乙醇醇析，靜置后于3000-5000rpm下離心10-20min，取下層沉淀，于-70~-50℃下冷凍干燥得粗多糖。再使用2種纖維素柱層析法分離純化多糖，即得高純度多糖組分。本方法與傳統方法相比，降低了成本，而且大幅提高了產出效率，所得多糖產品，純度可達96%以上。
文檔編號A23K1/16GK102212144SQ201110094138
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月15日 優先權日2011年4月15日
發明者張勇, 朱宇旌, 王翀 申請人:沈陽農業大學