專利名稱：一種農桿菌轉化大豆的方法
技術領域：
本發明屬于植物轉基因技術領域，具體說是一種農桿菌介導轉化大豆子葉節的方法。
背景技術：
早在1988年由Hinchee第1個以農桿菌介導法獲得大豆轉基因植株，農桿菌介導的大豆子葉節遺傳轉化仍然是目前應用最廣泛的一種轉基因技術，這種方法有很多優點獲得再生植株的時間短、不可育的再生植株少、外植體來源不受時間限制；具有操作簡單、費用低廉、可插入基因片段大、不容易發生重排、拷貝數低且符合孟德爾遺傳規律等優點(Meurer et a. 1，1998；林樹柱等，2004，劉海坤2005)。但是也存在一些實際問題， 如子葉節細胞的轉化效率低，再生轉化細胞和再生芽的無效選擇，重復性很差，植株再生困難等仍然是該系統實施的瓶頸(Olhoft和SomerS2001等；林樹柱2004 ；姬月梅2009)。 (Biotechnolog. 1988，6: 915-922 ；Plant Cell Report, 1998. 18 180-186 ；植物生理與分子生物學報，2005, 31 (2) 126-134 ； Pla Cell R印.，2001，20:706-711 ；生物工程學報，2004，20 (6) 817-820 ；農業科學研究，2009，1 47-49)。在已公開的植物轉基因技術中，農桿菌介導大豆子葉節遺傳轉化獲得轉基因大豆植株經過以下步驟大豆無菌苗的培養，子葉節制備，農桿菌侵染與共培養，不定芽誘導篩選培養，不定芽生根，植株移栽，轉化苗開花結莢獲得種子。自1988年Hinchee等首次報告農桿菌轉化大豆成功，之后的研究很多都沿用了這種方法，但是農桿菌介導的大豆子葉節遺傳轉化效率至今仍沒有取得很大突破，原因是大豆轉基因的實際操作是一個較復雜的過程，每一個操作步驟都會對最終的轉化效率有影響，甚至起決定作用。在農桿菌介導大豆子葉節遺傳轉化操作過程中，侵染和共培養這兩個步驟是農桿菌粘附在外植體表面和外源基因進入植物細胞及整合到植物基因組的過程，因此對轉化率起決定作用。這兩個步驟要求合適的侵染時間、侵染液濃度、共培養的時間、溫度和合適的共培養基成分及其PH值等。子葉節系統目前通常采用的侵染時間一般在10-30min，侵染農桿菌液濃度在0D600=0. 3-1. 0 ；目前通常采用的共培養基的pH為5. 4，共培養條件是溫度為22- °C、 完全黑暗，共培養時間為3d，轉化效率一般在3%以下，而且不穩定。Chen認為大豆的轉化率一般為0.5 % 1.8 %，李明春等報道的轉化率為1.27 %,崔欣的轉化率為0.49 % 0.91 96，段瑩瑩的子葉節轉化法轉化率為1.86%，呂慧穎研究表明，轉化率為2. 39 %，姬丹丹轉化率為 2. 2-2. 5% (Plant Cell Tissue Organ Cult. , 2007，89: 177-183 ；Acata Botan Sine, 2004 , 46 (5) :610-617 ；農業科學研究，2009,30 (1)47-49 ；分子生物學報，2007, 40(5): 286-294 ；大豆科學，2010,29 (1): 8-12;山東大學學報(理學版 )2011,46(5)117-121，)。研究者們相繼在①大豆基因型；②農桿菌菌株和Ti質粒； ③外植體類型；④共培養基中酚類化合物和抗氧化劑種類及轉化時合適的篩選劑等各種技術性環節進行了探索，每個試驗研究的轉化效率都有所提高(農業科學研究，2009,1 47-49)。
另外，共培養基的pH是遺傳轉化效率最直接的影響因素。農桿菌和外植體大豆子葉節均與培養基直接接觸，農桿菌的生長及T-DNA向植物細胞轉移的活性均受環境pH影響，農桿菌生長的適宜PH為6-9，因此給農桿菌創造一個合適的環境很重要，目前通用的pH 為5. 4。武小霞等研究結果顯示，大豆遺傳轉化共培養基的pH在5. 2-5. 6范圍內為宜，不定芽誘導率最高；趙曉雯認為PH值是影響遺傳轉化效率的最主要因素，最適宜pH為5. 2， PCR陽性率1.06-5%，平均為2.27% (東北農業大學學報，2010，41(5) 1_4 ；大豆科學， 2011. 30 (3) :362-368)ο此外，共培養的時間是農桿菌介導的大豆遺傳轉化過程中重要的影響因素。共培養的過程是附著在傷口的農桿菌不斷繁殖和T-DNA的轉入和與植物基因組整合的過程，完成該過程至少需要16h，因為“細胞的調節期”大致為16h。理論上共培養的時間越長，農桿菌就會繁殖越多，完成轉化的幾率越大，但是時間過長，農桿菌會過度繁殖，使外植體遭受毒害而死亡(王關林1998)，目前一般認為大豆子葉節遺傳轉化的最佳共培養時間為3d。(植物基因工程原理與技術.科學出版社，1998; Plant Cell Rep. , 1998,18:180-186)。同樣，光照條件也是影響共培養的重要因素，農桿菌是生存在土壤中的一種菌，黑暗是它的自然生存環境狀態。共培養時，黑暗條件有利于農桿菌的生長，而光照有利于大豆子葉節分生細胞分裂，因此協調滿足農桿菌和大豆子葉節分化的需要對轉化很重要。關于共培養光照條件的研究很少，之前的報道認為共培養在黑暗條件下比在光照條件下效果更好，目前通用的方法是在完全黑暗條件下進行共培養(中國農業科學，2008，41(3): 661-668 ；分子生物學報，2007, 40(5): 286-294)。因此，農桿共培養是農桿菌完成轉化大豆子葉節的關鍵階段，是獲得轉基因植株的前提，改良共培養階段的重要影響因素，會有效提高大豆子葉節遺傳轉化效率。
發明內容
本發明的目的是提供一種農桿菌轉化大豆的方法，通過優化共培養基pH值、共培養時間和共培養期間的光照方式，提高了農桿菌轉化高大豆子葉節的效率。本發明是通過以下技術方案實現的
1、對干燥的大豆種子用氯氣法進行消毒12-1 ，接種到萌發培養基上萌發4-6d，獲得無菌苗，切制大豆子葉節；
2、用液體培養基，其成分為1/10B5+1. 7mg/L 6-BA+200 μ mol/L乙酰丁香酮+400mg/ L L-半胱氨酸+lmmol/L 二硫蘇糖醇+lmmol/L硫代硫酸鈉+3mmol/L MES+3%蔗糖，pH值為 6. 0-7. 2，調制活化的農桿菌菌液達到0D600為0. 4-0. 6，然后侵染子葉節30-60min ；
3、將上述的子葉節轉移到共培養基上，共培養基成分為1/10B5+1. 7mg/L 6-BA+200 μ mol/L乙酰丁香酮+400mg/L L-半胱氨酸+lmmol/L 二硫蘇糖醇+lmmol/L硫代硫酸鈉 +3mmol/L MES+3% 蔗糖 +0. 8% 瓊脂，pH 值為 6. 0-7. 2，在 0_16h/d 光照、22_25°C條件下，共培養3-10天；
4、將上述共培養后的大豆子葉節進行脫菌后，轉到不定芽誘導及篩選培養基上進行芽誘導及篩選培養，15天繼代一次，直到抗性芽長出，誘導及篩選培養基成分為B5 +1. 7mg/L 6-BA +100mg/LKm +250mg/LCarb +250mg/LCef+3% 蔗糖 +0. 8% 瓊脂，pH=5. 8 ；
5、將上述的抗性芽轉移到芽伸長培養基上，芽伸長培養基成分為B5+ 1. 0mg/LGA3 +100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3% 蔗糖+0. 8% 瓊脂，pH=5. 8 ；
6、抗性芽生長到4-6cm后，轉移到生根培養基上，生根培養基成分為1/2MS+1.Omg/L IBA+0. 2mg/L NAA+250mg/LCef+3% 蔗糖 +0. 8% 瓊脂，pH=5. 8 ；
7、當根長達到4-6cm后，將苗移栽到營養土中，將苗用薄膜覆蓋，待新葉長出后去掉薄膜，獲得轉化植株。在本發明中，所述的共培養基的PH值，優選的PH范圍為6. 0-7. 2，最佳pH值為
6. 6ο進一步地，所述的共培養優選7-10天；最佳為10天。進一步地，所述的共培養期間的光照時間在優選12-Wh/d ；最佳為16h/d。本發明的有益效果
本發明獲得的農桿菌轉化大豆子葉節的共培養方法，可顯著提高農桿菌轉化大豆子葉節的效率，對加快大豆轉基因育種有重要的理論及實踐意義。本發明的一個特點是選用共培養基pH在6. 0-7. 2范圍內，轉化率分別達到 4. 67%、5. 59%和5. 43%，轉化率均高于目前通用的pH 5. 4，提高了 3-3. 5倍，以pH6. 6最高， 見表1。表1不同pH值對大豆子葉節轉化效率的影響
權利要求
1.一種農桿菌轉化大豆的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)對干燥的大豆種子用氯氣法進行消毒12-16h，接種到萌發培養基上萌發4-6d，獲得無菌苗，切制大豆子葉節；(2)用液體培養基，其成分為1/10B5+1. 7mg/L 6-BA+200 μ mol/L乙酰丁香酮 +400mg/L L-半胱氨酸+lmmol/L 二硫蘇糖醇+lmmol/L硫代硫酸鈉+3mmol/L MES+3%蔗糖，PH值為6. 0-7. 2，調制活化的農桿菌菌液達到0D600為0. 4-0. 6，然后侵染子葉節 30_60min ；(3)將上述的子葉節轉移到共培養基上，共培養基成分為1/10B5+1. 7mg/L6-BA+200μ mol/L乙酰丁香酮+400mg/L L-半胱氨酸+lmmol/L 二硫蘇糖醇+lmmol/L硫代硫酸鈉 +3mmol/L MES+3% 蔗糖 +0. 8% 瓊脂，pH 值為 6. 0-7. 2，在 0_16h/d 光照、22_25°C條件下，共培養3-10天；(4)將上述共培養后的大豆子葉節進行脫菌后，轉到不定芽誘導及篩選培養基上進行芽誘導及篩選培養，15天繼代一次，直到抗性芽長出，誘導及篩選培養基成分為B5 +1. 7mg/ L 6-BA +100mg/LKm +250mg/LCarb +250mg/LCef+3% 蔗糖+0. 8% 瓊脂，pH=5. 8 ；(5)將上述的抗性芽轉移到芽伸長培養基上，芽伸長培養基成分為B5+ 1. 0mg/LGA3 + 100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3% 蔗糖+0. 8% 瓊脂，pH=5. 8 ;(6)抗性芽生長到4-6cm后，轉移到生根培養基上，生根培養基成分為1/2MS+1.0mg/L IBA+0. 2mg/L NAA+250mg/LCef+3% 蔗糖 +0. 8% 瓊脂，pH=5. 8 ；(7)當根長達到4-6cm后，將苗移栽到營養土中，將苗用薄膜覆蓋，待新葉長出后去掉薄膜，獲得轉化植株。
2.根據權利要求1所述的農桿菌轉化大豆的方法，其特征在于，所述的共培養基的PH 值，優選的PH范圍為6. 0-7. 2，最佳pH值為6.6。
3.根據權利要求1所述的農桿菌轉化大豆的方法，其特征在于，所述的共培養優選7-10天；最佳為10天。
4.根據權利要求1所述的農桿菌轉化大豆的方法，其特征在于，所述的共培養期間的光照時間在優選12-Wh/d ；最佳為16h/d。
全文摘要
本發明公開了一種農桿菌轉化大豆的方法，包括對干燥的大豆種子用氯氣法進行消毒，接種到萌發培養基上萌發，獲得無菌苗，切制大豆子葉節，用液體培養基，調制活化的農桿菌菌液，調整pH值，然后侵染子葉節，將子葉節轉移到共培養基上，調整pH值，在光照條件下進行共培養，將共培養后的大豆子葉節進行脫菌后，轉到不定芽誘導培養基上進行芽誘導及篩選培養，15天繼代一次，直到抗性芽長出；抗性芽經過伸長、生根、移栽、對植株進行鑒定，獲得轉化植株。本發明獲得的農桿菌轉化大豆子葉節的共培養方法，可顯著提高農桿菌轉化大豆子葉節的效率，對加快大豆轉基因育種有重要的理論及實踐意義。
文檔編號A01H5/00GK102304545SQ20111026247
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月7日 優先權日2011年9月7日
發明者喬亞科, 崔姍姍, 李桂蘭, 王盧平, 鐘磊 申請人:河北科技師范學院