一種表達纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白構建纖維素酶高產菌株的方法
【專利摘要】本發明公開了一種表達纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白構建纖維素酶高產菌株的方法，屬于酶工程領域。該方法為通過同源重組和基因工程技術將具有纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白的編碼基因整合到黑曲霉熱激蛋白基因的位置。首先合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的同源重組片段，用 Sal I酶切該重組片段和pWM1質粒再連接轉化DH5α得到同源重組質粒；用該同源重組質粒轉化農桿菌，通過農桿菌介導轉化得到纖維素酶高產黑曲霉菌株。本發明利用熱激表達實現了通過提高溫度大幅度增加目的蛋白的表達，從而更顯著的提高纖維素外切酶和內切酶的活性，增加纖維素酶的酶活。
【專利說明】一種表達纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白構建纖維素酶高產菌株的方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于酶工程領域，具體涉及一種表達纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白構建纖維素酶高產黑曲霉菌株的方法。
【背景技術】
[0003]纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產生的纖維素達到100億噸左右，利用纖維素生產生物能源，是緩解能源危機、實現人類可持續發展的關鍵。
[0004]纖維素利用的關鍵是把纖維素降解為可發酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中，外切酶降解纖維素的晶體結構，是纖維素酶降解纖維素的限速步驟，內切酶降解長片段的纖維素成為二聚體，是纖維素降解的關鍵步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色、條件溫和、轉化率高的特點，但是纖維素較高的生產成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。
[0005]獲得高產纖維素酶的菌株，降低纖維素酶的生產成本成為纖維素酶工業化利用的必由之路。纖維素酶的生產菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其較高的安全性，被認為是生產纖維素酶最有應用前景的菌株之一。黑曲霉生產的纖維素酶由纖維素內切酶、葡糖苷酶和外切酶組成。其中外切酶破壞纖維素晶體結構，把晶體纖維素降解為可溶性的纖維素片段，該過程是纖維素降解的限速步驟。纖維素的高效降解需要大量的纖維素外切酶。然而，黑曲霉生產的纖維素酶中，葡糖苷酶的活性比外切酶的活性和內切酶的活性高的多。由于黑曲霉產生的纖維素外切酶活性和內切酶活性的不足，致使黑曲霉產生的纖維素酶對天然纖維素的降解效率非常低。因此增加纖維素外切酶和內切酶的活性，成為提高黑曲霉纖維素酶降解效率的重要措施。
[0006]現有的增加黑曲霉纖維素酶的方法有和高外切酶活性的纖維素酶混合或黑曲霉菌株與里氏木霉混菌發酵。與高外切酶活性纖維素酶的混合，本身就增加了混合這一道工藝，增加了降解成本。而且高外切酶活性的纖維素酶成本也較高。混菌發酵由于里氏木霉產生毒素，大大限制了纖維素酶的使用范圍。
[0007]已報道的構建黑曲霉纖維素酶高產菌株的方法是導入的基因與黑曲霉已有纖維素酶的基因共同表達，但是表達的酶僅僅具有一種活性，不能同時增加內切酶和外切酶的活性。同時已有的基因工程菌不能通過條件(溫度、酸度等)控制單一的大幅度增加某一種酶的表達，對纖維素酶酶系組成的改變有限。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種表達纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白構建纖維素酶高產黑曲霉菌株的方法。本發明的目的還在于提供一種基于該方法構建得到的纖維素酶高產黑曲霉菌株。
[0009]本發明的目的通過下述技術方案實現:
一種表達纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白構建纖維素酶高產黑曲霉菌株的方法，為通過同源重組和基因工程技術將具有纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白的編碼基因整合到黑曲霉熱激蛋白基因的位置。
[0010]一種纖維素酶高產黑曲霉菌株，為在熱激蛋白基因的位置整合有纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白編碼基因的黑曲霉菌株。
[0011]所述的纖維素酶高產黑曲霉菌株的構建方法優選包含如下步驟:
(I)合成黑曲霉熱激蛋白基因的前段序列-纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白的編碼序列-黑曲霉熱激蛋白基因的后段序列的同源重組片段，該同源重組片段兩端含有限制性內切酶酶切位點；將該重組片段連接到pWMl質粒上得到同源重組質粒。
[0012](2)用同源重組質粒轉化農桿菌。
[0013](3)通過農桿菌介導轉化得到目的菌株。
[0014]優選的，步驟(I)為:合成核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的同源重組片段，用Sall酶切；將？麗1質粒也用SaR酶切；將酶切后的重組片段和質粒通過DNA連接酶連接，并轉化DH5ci得到同源重組質粒。
[0015]本發明通過同源重組技術，合成黑曲霉熱激蛋白編碼序列的前后兩段作為同源重組序列，把具有纖維素內切酶和外切酶的蛋白編碼序列連接，通過基因工程技術，讓具有纖維素內切酶和外切酶活性的蛋白整合到熱激蛋白的位置，構建出熱激表達的菌株，構建的菌株纖維素酶的6.7U/g，是出發菌株5.6U/g的1.2倍。
[0016]本發明的黑曲霉菌株能夠內表達外切酶和內切酶活性的蛋白，為纖維素酶的高產菌株。本發明最大的優點是通過表達一種蛋白，能同時增加外切酶和內切酶的活性，更具有創新意義的是利用熱激表達實現了通過提高溫度大幅度增加目的蛋白的表達，從而更顯著的提高纖維素外切酶和內切酶的活性，增加纖維素酶的酶活。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例用于進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制，在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換均屬于本發明的范圍。若為特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0018]實施例1
A、同源重組質粒的構建
(I)材料:黑曲霉fliger)、大腸桿菌(萬.coliΛΗ5 α、農桿菌ΕΗΑ105和質粒P麗I均為商業化產品。其中，黑曲霉從ATCC購買，菌株編號ATCC10582 ;農桿菌ΕΗΑ105和質粒pMWl從B1vector公司購買。
[0019](2)同源重組片段的合成及酶切
合成由黑曲霉熱激蛋白基因的前段同源序列(該序列可能的起始密碼子被其它堿基替代以確保轉錄從雙活性蛋白的起始密碼子開始，序列如SEQ ID N0.2所示)一纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白的編碼序列(SEQ ID N0.3)—黑曲霉熱激蛋白基因的后段同源序列(SEQ ID N0.4)組成的同源重組片段(核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)。
[0020]往100 μ L該同源重組片段中加入Sal\酶液2 μ L (TakaRa購買)，30°C酶切16h，酶切后65°C水浴1min。
[0021](3) P麗I質粒的提取及酶切
含有P麗I質粒的大腸桿菌E.coli DH5 α于LB中(50 μ g/mL的卡那霉素)37°C振蕩培養12h。取1.5mL菌體于EP管，以4000rpm離心3min,棄上清液。加0.1mL溶液K 1%葡萄糖，50mM EDTA pH8.0,25mM Tris-HCl ρΗ8.0)充分混合。加入 0.2mL 溶液 11(0.2mM NaOH,1% SDS)，輕輕翻轉混勻，置于冰浴5min。加入0.15mL預冷溶液III (5mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉混勻，冰浴5min。以1000rpm離心20min，取上清液于另一新EP管。加入等體積的異戊醇，混勻后靜置lOmin。再以1000rpm離心20min，棄上清。用70%乙醇0.5mL洗滌一次，抽干所有液體。待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE緩沖液中。
[0022]提取的pWMl質粒50 μ L加入SaR酶液2 μ L (TakaRa購買)，30°C酶切16h，酶切后 65°C水浴 1min。
[0023](4)連接
酶切的同源重組片段100μ L和酶切的pWMl質粒20μ L用5μ L Τ4 DNA IigaseCTakaRa購買)16°C連接24h。
[0024]B、大腸桿菌感受態細胞的制備
(I)將E.co7i DH5a置于LB培養基上，在37°C下過夜培養。
[0025](2)高溫滅菌大的離心瓶(250_500mL)以備第二天搖瓶用。
[0026](3)準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用。
[0027](4)轉移0.2-lmL過夜培養物至裝有20mL LB(或其他營養豐富的培養基)的10mL搖瓶。
[0028](5) 37°C下劇烈振蕩培養6小時。
[0029](6)監控培養液0D_值(培養I小時后每半小時測定一次)。
[0030](7)當OD6tltl值達到0.5-1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘。
[0031](8)細胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液。
[0032](9)用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。
[0033]( 10)照上面步驟重復離心，小心棄去上清液。
[0034]( 11)照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞。
[0035](12)離心，棄上清液。
[0036](13)用20mL滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞。
[0037](14)照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉淀可能會很松散)。
[0038](15)用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2_3mL。
[0039](16)將細胞按150 μ L等份裝入微量離心管，于_80°C保存。
[0040]C、連接產物轉化大腸桿菌
(I)在冰上解凍B步驟制得的感受態細胞。
[0041](2)每100 μ L感受態細胞添加10 μ L連接的質粒(Α步驟(4)的連接產物)，冰上培育約5分鐘。
[0042](3)轉移DNA/細胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器中。
[0043](4)加載電轉化儀，準備好300 μ L LB培養基。
[0044](5)對電穿孔容器進行脈沖(200歐姆，25 μ Fd，2.5千伏)(檢查時間常數，應該在3以上)。
[0045](6)立即添加300 μ L的LB至電穿孔容器中。
[0046](7) 37°C下培養細胞40分鐘至I小時以復原。
[0047](8)轉移細胞至含有卡那霉素(5(^g/mL)選擇培養基上培養，長出的菌落為含有同源重組質粒(連入同源重組片段的PMWl質粒)的轉化子。
[0048]D、同源重組質粒的提取
C步驟得到的轉化子37°C振蕩培養12h。取1.5mL菌液于EP管中，以4000rpm離心3min，棄上清液。加 0.1mL 溶液 1( 1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。加入0.2mL溶液II (0.2mM NaOH, 1% SDS)，輕輕翻轉混勻，置于冰浴5min。加入0.15mL預冷溶液III (5mol/L KAc, pH4.8)，輕輕翻轉混勻，冰浴5min。以1000rpm離心20min，取上清液于另一新EP管中。加入等體積的異戊醇，混勻后靜置lOmin。再以1000rpm離心20min,棄上清。用70%乙醇0.5mL洗漆一次,抽干所有液體。待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE緩沖液中。
[0049]E、同源重組質粒轉化農桿菌
農桿菌感受態的制備:液體保存的農桿菌EHA105涂布于LB培養基上，28°C培養，等到單菌落長出后，挑取單菌落，接種于5mL的液體培養基中，28°C、150r/m培養24h，按照I: 10的接種比例接種于5mL新鮮的液體培養基中，280C、150r/m培養24h。培養的菌體冰浴40min, 5000r/m 離心 5min,用 10mT,的 0.02mol/L 0&012菌體重懸菌體。再次 5000r/m 離心5min,菌體懸浮于ImL的0.02mol/L CaCl2溶液,放置于冰上保藏。
[0050]取提取的同源重組質粒I μ L與40 μ L的農桿菌感受態懸液混合，輕輕搖動混合5min后，在液氮上迅速冰凍5min，37°C水浴5min。加入ImL液體LB培養基，28°C輕輕震蕩4h。菌體5000r/m離心5min，棄去上清液，加入LB培養基50yL，震蕩重新懸浮液體。液體涂布于含有5(^g/mL卡那霉素LB平板上，長出的菌落接種于含有5(^g/mL卡那霉素的LB液體培養基中28 °C、150r/m培養24h。
[0051]F、農桿菌介導轉化黑曲霉
黑曲霉接種于PDA培養基斜面上，37°C培養72h，用滅菌的蒸餾水沖洗下孢子，孢子用蒸餾水稀釋到18個孢子/mL。孢子與等體積的含有同源重組質粒的農桿菌混合均勻，加入乙酰丁香酮至200 μ mol/L, 30°C避光培養24h。然后把孢子涂布在平板上(200g 土豆用自來IL水煮沸30min，紗布過濾，加入20g葡萄糖、20g可溶性淀粉、20g瓊脂、200 μ mo I頭孢噻肟、200mg潮霉素B)，30°C培養到長出菌落。
[0052]長出的菌落分別接種到斜面上(200g 土豆用自來IL水煮沸30min，紗布過濾，加入20g葡萄糖、20g瓊脂)，30°C培養72h，用接種環刮取孢子，接種到麩皮培養基中(麩皮:自來水=1:3 (W/W))，每個250mL三角瓶裝入30g麩皮培養基，30°C培養4d，然后升溫到39°C保溫12h，降溫到28°C培養Id。逐一測定每個轉化子的纖維素酶酶活，酶活高的為轉化子。篩選得到一個纖維素酶酶活達到6.7U/g的菌株，是出發菌株5.6U/g的1.2倍。對篩選的菌株進一步測序證實纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白的編碼基因已整合到黑曲霉熱激蛋白基因的位置，表明本發明表達纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白構建纖維酶高產菌株構建成功。
[0053]將上述篩選的菌株接種到斜面上(200g土豆用自來IL水煮沸30min，紗布過濾，力口入20g葡萄糖、20g瓊脂)，30°C培養72h，用接種環刮取孢子，接種到麩皮培養基中(麩皮:自來水=1:3 (W/W))，250mL三角瓶裝入30g麩皮培養基，28°C培養5.5d。測定酶活為5.9U/g，這說明沒有熱激，纖維素酶酶活沒有熱激的酶活高，說明熱激表達策略使纖維素酶的酶活提聞。
[0054]纖維素酶酶活的測定方法:取發酵結束時的培養基5.0g,加入0.05M檸檬酸緩沖液50mL，200r/m浸提30min，濾紙過濾得到酶液。在50°C進行酶降解反應。在25mL試管中加入1mL pH 5.0的0.05M檸檬酸緩沖液，濾紙條(0.5cmX 2cm)兩片作為底物，加入發酵液離心后上清液2mL，在水浴鍋中50°C保溫30min，然后用沸水煮沸5min，用DNS法測定還原糖的含量。酶活定義為:每分鐘釋放出Iymol還原糖所需要的酶量為一個酶活單位U。
【權利要求】
1.一種表達纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白構建纖維素酶高產黑曲霉菌株的方法，其特征在于:為將具有纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白的編碼基因整合到黑曲霉熱激蛋白基因的位置。
2.—種纖維素酶高產黑曲霉菌株，其特征在于:為在熱激蛋白基因的位置整合有纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白編碼基因的黑曲霉菌株。
3.權利要求2所述的纖維素酶高產黑曲霉菌株的構建方法，其特征在于包含如下步驟: (1)合成黑曲霉熱激蛋白基因的前段序列-纖維素外切酶和內切酶雙活性蛋白的編碼序列-黑曲霉熱激蛋白基因的后段序列的同源重組片段，該同源重組片段兩端含有限制性內切酶酶切位點；將該重組片段連接到PWMl質粒上得到同源重組質粒； (2)用同源重組質粒轉化農桿菌； (3)通過農桿菌介導轉化得到目的菌株。
4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于步驟(I)為:合成核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的同源重組片段，用Sall酶切；將P麗I質粒也用Sall酶切；將酶切后的重組片段和質粒通過DNA連接酶連接，并轉化DH5 α得到同源重組質粒。
【文檔編號】C12N15/80GK104480139SQ201410824320
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月26日 優先權日:2014年12月26日
【發明者】薛棟升 申請人:湖北工業大學