專利名稱：一種一菌多酶菌株及其篩選方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種一菌酶菌株，同時還涉及該菌株的篩選方法及應用，屬于微生物技術領域。
背景技術：
酶是一種生物催化劑，飼用酶制劑作為一類高效、無毒副作用的環保型“綠色”飼料添加劑廣泛應用于在動物生產中，應用飼用酶制劑既能提高飼料的消化率和利用率，提高畜禽及水產動物的生產性能，又能減少排泄物中氮、磷含量，保護水體和土壤免受污染， 將有著十分廣闊的應用前景。
早期的酶制劑以動植物作為原料直接提取，但由于動植物生長周期長，又受地理、 氣候和季節等多種因素的影響，不適于大規模的工業生產。目前人們已將目光轉向以微生物作為酶制劑的主要來源，如淀粉酶和蛋白酶的微生物制備使用于工業化生產。早期的復合酶制劑是通過單酶復配后再使用，此種方式易造成生產成本過高，質量不穩定，使用不方便。發明內容
本發明的目的在于提供一種一菌多酶菌株。
同時，本發明的目的還在于提供一種該一菌多酶菌株的篩選方法。
進一步地，本發明的目的還在于提供一種該菌多酶菌株的應用。
為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了一種一菌多酶菌株，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) I. 1111，保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏號為 CCTCC NO M 2011286。
應用經典的細菌鑒定方法及分子生物學方法16S rDNA對其進行鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bac illus subtilis) I. 1111，于2011年8月11日保藏在中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO M 2011286。
該枯草芽孢桿菌對對膽酸鹽、人工胃液、人工腸液等環境表現出很強的耐受能力， 對實驗動物安全無毒無副作用，并能產生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶多種酶，這有利于該菌株作為益生菌在飼料添加劑中的進一步開發利用， 為進一步研究各酶的性質、各酶之間的相互關系、實現一菌多酶發酵奠定了良好的基礎。
所述的一菌多酶菌株可產木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、 脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶。
本發明的技術方案還采用了一種一菌多酶菌株的篩選方法，包括以下步驟以產木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶為篩選目標，分別用各酶選擇性培養基，根據菌落周圍有無透明圈或水解圈，以及透明圈或水解圈的直徑(D)與菌落直徑(d)的比值，來初步判斷是否為產酶菌株及高產酶活，最終從實驗室分離、篩選保存的菌種資源庫中篩選到一菌產多酶的菌株。
本發明的技術方案還涉及一種該一菌多酶菌株在制備益生菌劑方面的應用。
斜面和種子培養基以g/L計蛋白胨10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面再加15-20， ρΗ7· 2 ;發酵培養基以 g/L 計玉米粉 36-44，豆餅粉 36-44，Na2HPO4 8，(NH4) 2SO4 4，NH4Cl 0.75，CaCl2 1.0，pH7. O ;培養條件10L發酵罐中發酵體積為7L，接種量為總體積10%， 溫度為35-40°C，通氣量為3L/L. min，攪拌速度為200-300r/min，發酵時間30_50h，發酵液中有大量的枯草芽孢桿菌活菌、以蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶為主，同時含有木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶等水解酶，將發酵液濃縮加入 30% -60%淀粉干燥即制成益生菌和復合酶制劑。
同時，本發明的技術方案還涉及一種一菌多酶菌株在制備飼料方面的應用。
復合酶制劑在飼料中的添加量為每噸飼料加100_200g。
所述的復合酶制劑組成為蛋白酶5000_10000U/g、甘露葡聚糖酶1000_3000U/g、 糖化酶 700-3000U/g，木聚糖酶 7500-15000U/g、淀粉酶 500_3000U/g、纖維素酶 200-700U/ g、植酸酶 50-80U/g、果膠酶 100-200U/g、脂肪酶 200_500U/g。
本發明的復合酶有不同的作用機制，在飼料中的添加可減少其抗營養作用，提高飼料利用率，提高動物生產效率，充分發揮動物的生產性能。本發明通過模擬體內膽酸鹽環境、人工胃液、人工腸液和動物試驗證明該菌株對膽鹽、人工胃液、人工腸液有很強的耐受能力，對試驗動物表現出安全性和促增長能力，這為有效提高該菌株的產酶能力，在發酵過程中能夠同時產生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，實現一菌多酶發酵奠定了基礎。該菌株產生的多種酶之間相互協同作用效果強，可作為飼料添加劑應用于畜、禽、水產動物等農業生產。
產酶菌株的篩選
I.產木聚糖酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在木聚糖酶篩選培養基上，在37°C恒溫培養24h，根據菌落周圍是否有透明圈產生，判斷其是否產生木聚糖酶。分別測量透明圈直徑和菌落直徑，根據兩者比值大小確定其分泌木聚糖酶活性的高低，并以比值大于等于2時判其為產木聚糖酶活性高的菌株。
2.產蛋白酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在酪蛋白瓊脂培養基上，在37°C溫箱中培養24h，根據菌落周圍是否有酪素水解圈產生，判斷其是否產生蛋白酶。用直尺分別測量水解圈與菌落的直徑，根據兩者比值大小確定其分泌蛋白酶活性的高低，并以比值大于等于2時判其為產蛋白酶活性高的菌株。
3.產植酸酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在植酸酶初篩培養基上，在30°C溫箱中培養48h，根據菌落周圍是否產生透明圈來判斷其是否產生植酸酶。用直尺分別測量透明圈的直徑(D)和菌落直徑(d)，根據兩者的比值大小來初步確定其產生植酸酶活性的高低，并以比值大于等于2 時判其為產植酸酶活性高的菌株。
4.產果膠酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在果膠酶初篩培養基上，在37°C溫箱中培養36h，取出后，在菌落周圍滴加幾滴CTAB溶液，靜置IOmin后觀察透明圈。根據菌落周圍是否產生透明圈來判斷其是否產生果膠酶。用直尺分別測量透明圈的直徑(D)和菌落直徑(d)，根據兩者的比值大小來初步確定其產生果膠酶活性的高低，并以比值大于等于2時判其為產果膠酶活性高的菌株。
5.產脂肪酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在脂肪酶初篩培養基上，在37°C溫箱中培養24h，根據菌落周圍是否產生水解圈來判斷其是否產生脂肪酶。分別測量水解圈的直徑(D)和菌落直徑 (d)，根據兩者的比值大小來初步確定其產生脂肪酶活性的高低，并以比值大于等于2時判其為產脂肪酶活性高的菌株。
6.產甘露聚糖酶菌株的篩選
將已活化的菌株刺種在甘露聚糖酶篩選培養基上，37°C培養24h后，用剛果紅水溶液檢測菌落周圍是否產生透明圈及其大小，作為產甘露聚糖酶篩選的依據。，并以比值大于等于2時判其為產甘露聚糖酶活性高的菌株。
7.產糖化酶菌株的篩選
將活化后的菌株刺種糖苷酶篩選培養基上，37°C培養36h，采用革蘭氏碘液染色， 在菌落周圍有透明圈產生證明其產糖化酶。分別測量透明圈直徑和菌落直徑，并以比值大于等于2時判其為產糖化酶活性高的菌株。
8.高產淀粉酶菌株的篩選
將活化后的菌株刺種可溶性淀粉培養基平皿上，在37°C溫箱中培養24h，采用革蘭氏碘液染色，根據菌落周圍是否有透明圈產生判斷其是否產生淀粉酶。分別測量透明圈直徑和菌落直徑，并以比值大于等于2時判其為高產淀粉酶的菌株。9.高產纖維素酶菌株的篩選
9.高產纖維素酶菌株的篩選
將活化后的菌株刺種纖維素酶篩選培養基上，在37°C溫箱中培養24h，采用Img/ ml剛果紅染色lh，然后依次用，lmol/LNaCl溶液徹底洗去染液lh，再用Imol/mlHCl定色， 根據菌落周圍是否形成染色圈，判斷芽孢桿菌是否產生纖維素酶。分別測量染色圈直徑和菌落直徑，以比值大于等于2的判其為活性比較高的纖維素酶產酶菌株。
一菌多酶發酵法可以大大提高生產效率、節約成本，而且由于各酶種來源于同一菌株，其安全性與復配性能顯得更有優勢。
產酶菌株的鑒定
應用普通瓊脂培養基對產酶菌株的培養特征進行研究，利用革蘭氏染色法對其染色特性進行研究；利用糖發酵試驗、IMVIC試驗、淀粉水解、明膠液化、硫化氫、賴氨酸脫羧酶試驗、精氨酸雙水解酶試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗等生化試驗對3其生理生化特性進行分析，并利用分子生物學方法16S rDNA對產酶菌株進行鑒定。
產酶菌株的耐受性及動物試驗
通過模擬體內膽酸鹽環境、人工胃液、人工腸液環境，分別測定產酶菌株在不同的膽鹽含量、不同PH值的人工胃液、不同pH值的人工腸液環境中的耐受能力。并選擇健康小白鼠為實驗動物，將菌株制成菌懸液(菌懸液活菌數為109CFU/mL)，同時設空白對照，連續灌胃5天，觀察小白鼠的健康狀況。
圖I為產酶菌株16S rDNA PCR擴增鑒定圖譜；泳道M為DL2000Marker ;泳道1、2 均為產酶菌株16S rDNA PCR擴增產物；泳道3陰性對照。
圖2產酶菌株的系統發育樹；▲為目的菌株。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細的描述
產酶菌株篩選實施例
I、產木聚糖酶菌株的篩選
將活化的產酶菌株刺種在木聚糖酶篩選培養基上，在37°C溫箱中培養24h，根據菌落周圍是否有透明圈產生，經過觀察，發現有該菌株產生透明圈，測量菌株的透明圈直徑 (D)、菌落直徑(d)及透明圈直徑與菌落直徑之比(D/d)，試驗結果見表I。
表I木聚糖酶分解菌酶活篩選結果
菌株D (mm)d (mm)D,/d 比值產酶菌株13.07.01.857
2.產蛋白酶菌株的篩選
將活化的產酶菌株刺種在酪蛋白瓊脂培養基上，在37°C溫箱中培養24h，觀察發現有該菌株株產生酪蛋白水 解圈。測量菌株的水解圈直徑(D)、菌落直徑(d)及水解圈直徑與菌落直徑之比(D/d)，試驗結果見表2。
表2蛋白酶分解菌酶活初篩
菌株D (mm)d (mm)D/d產酶菌株24.05. O4.80
3.產植酸酶菌株篩選結果
將活化的產酶菌株刺種在植酸酶初篩培養基平皿上，在30°C溫箱中培養48h后， 觀察發現菌株產生有透明圈，其透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及二者的比值見表3。
表3產值酸酶菌株篩選結果
菌株P (mm)d (mm)D./d產酶菌株179I. 889
由表3可知，該菌株的D/d值為2. 125，可初步確定這些菌株產植酸酶的活性較高。
4.產果膠酶菌株篩選結果
將活化的產酶菌株刺種在果膠酶初篩培養基平皿上，在37°C溫箱中培養36h后， 觀察發現該菌株產生透明圈，其透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及二者的比值見表4。
表4產果膠酶菌株篩選結果
權利要求
1.一種一菌多酶菌株，其特征在于，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) I. 1111，保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO M 2011286。
2.根據權利要求I所述的一菌多酶菌株，其特征在于可產木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶為高產酶活。
3.一菌多酶菌株的篩選方法，其特征在于包括以下步驟以產木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶為篩選目標，分別用各酶選擇性培養基，根據菌落周圍有無透明圈或水解圈，以及透明圈或水解圈的直徑(D)與菌落直徑(d)的比值，來初步判斷是否為產酶菌株及高產酶活，最終從實驗室分離、篩選保存的菌種資源庫中篩選到一菌產多酶的菌株。
4.一菌多酶菌株在制備益生菌劑方面的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于斜面和種子培養基以g/L計蛋白胨 10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面再加15-20，pH7. 2 ;發酵培養基以g/L計玉米粉36-44，豆餅粉 36-44，Na2HPO4 8，(NH4) 2SO4 4，NH4Cl O. 75，CaCl2 I. O, ρΗ7· O ;培養條件10L 發酵罐中發酵體積為7L，接種量為總體積10%，溫度為35-40°C，通氣量為3L/L. min，攪拌速度為 200-300r/min，發酵時間30_50h，發酵液中有大量的枯草芽孢桿菌活菌、以蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶為主，同時含有木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶等水解酶，將發酵液濃縮加入30% -60%淀粉干燥即制成益生菌和復合酶制劑。
6.—菌多酶菌株在制備飼料方面的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于復合酶制劑在飼料中的添加量為每噸飼料加 100-200g。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述的復合酶制劑組成為蛋白酶5000-10000U/g、甘露葡聚糖酶1000-3000U/g、糖化酶700_3000U/g，木聚糖酶 7500-15000U/g、淀粉酶 500-3000U/g、纖維素酶 200_700U/g、植酸酶 50_80U/g、果膠酶 100-200U/g、脂肪酶 200-500U/g。
全文摘要
本發明涉及一種一菌多酶菌株及其制備方法和應用，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1.1111，保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NOM 2011286。本發明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1.1111可產木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等9種酶的菌株，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶產量特別高。同時通過模擬體內膽酸鹽環境、人工胃液、人工腸液和動物試驗證明該菌株對膽鹽、人工胃液、人工腸液有很強的耐受能力，對試驗動物表現出安全性和促增長能力，這為有效提高該菌株的產酶能力，在發酵過程中能夠同時產生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，實現一菌多酶發酵奠定了基礎。該菌株產生的多種酶之間相互協同作用效果強，可作為飼料添加劑應用于畜、禽、水產動物等農業生產。
文檔編號A23K1/165GK102864091SQ201210010890
公開日2013年1月9日 申請日期2012年1月15日 優先權日2012年1月15日
發明者劉一塵, 張謙, 李宏偉, 張春杰, 汪洋, 關隨霞, 龔婷, 丁軻, 李小康, 吳庭才, 李銀聚, 王臣 申請人:河南科技大學