一株l?丙氨酸高產菌株的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物工程技術領域，提供了一株L?丙氨酸高產菌株，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLS1，保藏編號為CGMCC No.11764。本發明采用常溫常壓等離子體誘變并結合高通量篩選方法獲得上述L?丙氨酸高產菌株腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLS1，可大幅度提高L?丙氨酸的產量，且穩定性較好，菌株連續傳代5次后L?丙氨酸的產量無明顯變化。利用搖瓶實驗，L?丙氨酸的產量達120g/L。本技術發明完全符合工業L?丙氨酸菌株的誘變和篩選需要，并可應用于工業化發酵生產，具有重大的經濟價值。CGMCC No.1176420151130
【專利說明】
一株L-兩氨酸高產菌株
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物工程技術領域，提供了一株L-丙氨酸高產菌株。
【背景技術】
[0002]L-丙氨酸，又稱α-氨基丙酸，是一種α-氨基酸的左旋異構體，為白色結晶，具有特殊的甜味。廣泛應用于生物、醫藥、化工、食品、高分子材料等領域，用于制備藥物化合物合成甜味劑、測定肝功等，是一種應用范圍廣且具有巨大發展潛力的重要化工產品，越來越受到人們的歡迎和重視。
[0003]目前，L-丙氨酸可以采用化學合成法、酶法和發酵法生產。通過不同的化學合成途徑來生產各種氨基酸是化工行業常見的辦法，但是合成方法的產品質量差、回收率低、成本高和環境污染等，所以這種方法基本處于淘汰邊緣。酶法轉化，即通過富有L-天冬氨酸-β-脫羧酶活力的微生物(如德阿昆哈假單胞Pseudomonas dacunhae等)細胞催化L-天冬氨酸而得到。這種轉化工藝的特點是酶活力高、設備投資小，提取工藝簡單;但是其原材料L-天冬氨酸價格較貴，使該方法的生產成本較高。微生物發酵法與酶催化工藝相比有諸多優點:主要原料葡萄糖廉價易得，并且屬于可再生資源，成本可以保持穩定水平，培養成分簡單，厭氧發酵動力消耗低，產品收率高、成本低。
[0004]微生物發酵常用的菌株選育技術主要分為隨機選育和定向選育。雖然以分子生物學為基礎的基因工程、代謝工程以及由各種組學組成的系統生物學研究為定向構建功能細胞株提供了廣闊的前景，但是真正實現以這些功能細胞培養來達到改造目標卻很困難。由于微生物體內代謝網絡復雜性和多節點性，基因操作后菌株的代謝流往往并不朝著與其設計的方向轉移。因此，在一個復雜的代謝體系中，想要得到優良的生產菌株，主要還是采用隨機選育技術。長期以來針對菌株改良的隨機選育技術中主要采用的是紫外誘變和LiCl誘變等傳統的育種手段，且已經取得了一定的效果。高理所等報道了利用紫外線和激光燈組合誘變的方法篩選L-丙氨酸的高產菌株(安徽工程科技學院學報，2008,,23(1) 19-24)，但是由于紫外線對各種微生物的誘變效應不同，加上紫外的劑量大小很難把握，并且突變后存在光修復作用，所以紫外線誘變的效果不佳，正突變率效率較低，死亡率較高。
【發明內容】
[0005]本發明針對上述技術存在的不足，提供了一株L-丙氨酸高產菌株，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLSl，保藏編號為CGMCC N0.11764。本發明采用常溫常壓等離子體誘變并結合高通量篩選方法獲得上述L-丙氨酸高產菌株腸埃希氏菌(Escherichiacoli)EcQLSl，可大幅度提高L-丙氨酸的產量，且穩定性較好，菌株連續傳代5次后L-丙氨酸的產量無明顯變化。利用搖瓶實驗，L-丙氨酸的產量達120g/L。本技術發明完全符合工業L-丙氨酸菌株的誘變和篩選需要，并可應用于工業化發酵生產，具有重大的經濟價值。
[0006]本發明提供的一株L-丙氨酸高產菌株，其保藏號為CGMCCN0.11764;其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLSl ；
[0007]該菌株是以市場上直接購得的MG1655為出發菌株獲得的，其主要步驟是:先經過常壓常溫等離子體(ARTP)誘變處理獲得突變株，然后通過高通量篩選技術得到高產突變株，最后通過搖瓶驗證、傳代培養獲得遺傳性穩定的L-丙氨酸高產菌株并進行生物保藏；
[0008]更為具體的獲得方法如下:
[0009](I)利用常溫常壓等離子體誘變出發菌株
[0010]以MG1655作為出發菌株培養至對數后期，加無菌水稀釋至細胞密度OD6(K)mm值大于I，在無菌風下吹干，然后置于ARTP誘變系統進行等離子體照射0.5-6min;將樣品用生理鹽水洗下，常規梯度稀釋后涂布在平板LB固體培養基上，37°C培養15h;
[0011](2)突變株高通量初篩
[0012]挑取上述步驟所得的單菌落突變菌株，并接種于分別含有0.5mlLB固體培養基的96孔板和0.5ml LB液體發酵培養基的96孔板中，前者置于35?37°C靜置培養10?18h，后者置于35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;培養后檢測各孔發酵液中L-丙氨酸的含量，挑出產量高于出發菌株MG1655產量40 %的突變菌株，即為初篩高產菌株；
[0013]發明人采用這種方法，含有0.5mlLB固體培養基的96孔板和0.5ml LB液體發酵培養基的96孔板中同一個位置的菌是同一株，而LB固體培養基用于保存菌株，LB液體發酵培養基則用于檢測產量，這樣經過LB液體發酵培養基培養篩選出的菌株，可以從同一個位置的LB固體培養基中直接獲得；
[0014](3)突變株高通量復篩
[0015]將步驟(2)所得的高產突變株的LB固體培養基上的固體培養物接種于裝有
0.5mlLB液體發酵培養基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;以10%的接種量轉接到裝有0.5mlLB液體發酵培養基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;培養后，檢測各孔中發酵液的L-丙氨酸的含量，挑取L-丙氨酸的含量高于出發菌株MG1655產量40 %的突變株，即為復篩高產菌株；
[0016](4)突變株搖瓶驗證
[0017]將步驟(3)所得的高產突變株的LB固體培養基上的固體培養物接種于裝有30?50mlLB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;以10%的接種量轉接到裝有30?50mlLB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min繼續震蕩培養12?20h;
[0018](5)突變株遺傳穩定性驗證
[0019]將經搖瓶驗證過的高產菌株經步驟(4)中250ml搖瓶連續培養5代，檢測高產菌株的遺傳穩定性，選取穩定性好且L-丙氨酸產量最高的菌株進行保藏。
[0020]其中檢測各孔發酵液中L-丙氨酸含量的方法，采用常規HPLC檢測方法，發明人在此不再贅述；
[0021]綜上所述本發明采用常溫常壓等離子體誘變并結合高通量篩選方法獲得上述L-丙氨酸高產菌株腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLSl，可大幅度提高L-丙氨酸的產量，且穩定性較好，菌株連續傳代5次后L-丙氨酸的產量無明顯變化。利用搖瓶實驗，L-丙氨酸的產量達120g/L，較出發菌株MG1655提高了 75%。本技術發明完全符合工業L-丙氨酸菌株的誘變和篩選需要，并可應用于工業化發酵生產，具有重大的經濟價值。
[0022]發明人對L-丙氨酸高產菌株腸埃希氏菌EcQLSl進行了生物保藏，保藏信息如下:
[0023]保藏信息
[0024]保藏時間:2015年11月30日
[0025]保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)
[0026]保藏編號:CGMCCN0.11764
[0027]保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號
[0028]分類命名:大腸埃希氏細菌(Escherichia coli)
【附圖說明】
[0029]圖1為L-丙氨酸產生菌的菌落形態；
[0030]可見本發明所獲得的L-丙氨酸產生菌菌落形態，與常規無顯著變化。
【具體實施方式】
[0031]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0032]實施例1利用常溫常壓等離子體(ARTP)誘變出發菌株
[0033]以MG1655作為出發菌株培養至對數后期，加無菌水稀釋至細胞密度0D6QQmm值大于I，在無菌風下吹干，然后置于ARTP誘變系統進行等離子體照射0.5-6min;將樣品用生理鹽水洗下，常規梯度稀釋后涂布在平板LB固體培養基上，37°C培養15h。
[0034]實施例2突變株高通量初篩
[0035]挑取上述步驟所得的單菌落突變菌株，并接種于分別含有0.5mlLB固體培養基的96孔板和0.5ml LB液體發酵培養基的96孔板中，前者置于35?37°C靜置培養10?18h，后者置于35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;培養后檢測各孔發酵液中L-丙氨酸的含量，挑出產量高于出發菌株MG1655產量40 %的突變菌株，即為初篩高產菌株。
[0036]實施例3突變株高通量復篩
[0037]將步驟(2)所得的高產突變株的LB固體培養基上的固體培養物接種于裝有
0.5mlLB液體發酵培養基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;以
0.05ml的接種量轉接到裝有0.5mlLB液體發酵培養基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;培養后，檢測各孔中發酵液的L-丙氨酸的含量，挑取L-丙氨酸的含量高于出發菌株MG1655產量40%的突變株，即為復篩高產菌株。
[0038]實施例4突變株搖瓶驗證
[0039]將步驟(3)所得的高產突變株的LB固體培養基上的固體培養物接種于裝有30?50mlLB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;以10%的接種量轉接到裝有30?50mlLB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min繼續震蕩培養12?20h。
[0040]實施例5突變株遺傳穩定性驗證
[0041 ]將經搖瓶驗證過的高產菌株經步驟(4)中250ml搖瓶連續培養5代，檢測高產菌株的遺傳穩定性，選取穩定性好且L-丙氨酸產量最高的菌株進行保藏，保藏編號為CGMCCN0.11764。
[0042]實施例6利用突變株EcQLSl在10L發酵罐中發酵生產L-丙氨酸
[0043]將本發明中保藏號為CGMCC N0.11764的大腸埃希氏細菌(Escherichia coli)活化后制成菌懸液接入種子培養基中，于36°C，200r/min搖床中培養16h,
[0044]再以3vt%接種量接至100L發酵罐中培養，發酵溫度為36°C，轉數200r/min，發酵過程pH會下降，故而流加濃度10 %的尿素水溶液，維持發酵液的pH在6?7;發酵36h后停止發酵，HPLC檢測發酵液中L-丙氨酸濃度為120g/L。
[0045]可見利用該保藏菌株生產L-丙氨酸，可大幅度提高L-丙氨酸的產量，且穩定性較好，菌株連續傳代5次后L-丙氨酸的產量無明顯變化；利用搖瓶實驗，L-丙氨酸的產量達120g/L，較出發菌株MG1655提高了 75%;本技術發明完全符合工業L-丙氨酸菌株的誘變和篩選需要，并可應用于工業化發酵生產，具有重大的經濟價值。
【主權項】
1.一株L-丙氨酸高產菌株，命名為大腸埃希氏菌EcQLSl，保藏編號為CGMCC N0.11764。2.權利要求1所述的L-丙氨酸高產菌株的獲得方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)利用常溫常壓等離子體誘變出發菌株 以MG1655作為出發菌株培養至對數后期，加無菌水稀釋至細胞密度OD6(X)mffi值大于I，在無菌風下吹干，然后置于ARTP誘變系統進行等離子體照射0.5-6min;將樣品用生理鹽水洗下，常規梯度稀釋后涂布在平板LB固體培養基上，37 °C培養15h; (2)突變株高通量初篩 挑取上述步驟所得的單菌落突變菌株，并接種于分別含有0.5ml LB固體培養基的96孔板和0.5ml LB液體發酵培養基的96孔板中，前者置于35?37°C靜置培養10?18h，后者置于35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;培養后檢測各孔發酵液中L-丙氨酸的含量，挑出產量高于出發菌株MG1655產量40%的突變菌株，即為初篩高產菌株； (3)突變株高通量復篩 將步驟(2)所得的高產突變株的LB固體培養基上的固體培養物接種于裝有0.5mlLB液體發酵培養基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;以10%的接種量轉接到裝有0.5mlLB液體發酵培養基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;培養后，檢測各孔中發酵液的L-丙氨酸的含量，挑取L-丙氨酸的含量高于出發菌株MG1655產量40 %的突變株，即為復篩高產菌株； (4)突變株搖瓶驗證 將步驟(3)所得的高產突變株的LB固體培養基上的固體培養物接種于裝有30?50mlLB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養12?20h;以10%的接種量轉接到裝有30?50mlLB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min繼續震蕩培養12?20h; (5)突變株遺傳穩定性驗證 將經搖瓶驗證過的高產菌株經步驟(4)中250ml搖瓶連續培養5代，檢測高產菌株的遺傳穩定性，選取穩定性好且L-丙氨酸產量最高的菌株進行保藏。
【文檔編號】C12N13/00GK106047740SQ201610021887
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年1月14日 公開號201610021887.1, CN 106047740 A, CN 106047740A, CN 201610021887, CN-A-106047740, CN106047740 A, CN106047740A, CN201610021887, CN201610021887.1
【發明人】邱磊, 李嬌嬌, 戰偉偉, 趙佩玉, 李敬龍
【申請人】齊魯工業大學, 常州市金壇釀造機械有限公司