廈門霉素高產菌株及其培養基、用圖
【專利摘要】本發明公開了一種生物技術領域的廈門霉素高產菌株及其培養基、用途；具體涉及廈門霉素生物合成的高產基因工程菌株(Streptomyces xiamenensis)318Pls1 CGMCC No.12366的構建及培養基優化；通過生物合成基因簇的位點特異性整合，在廈門鏈霉菌基因組的核心區導入額外的廈門霉素生物合成基因簇，強化了廈門霉素的生物合成能力。并通過優化的培養基組合，實現了廈門霉素產量的大幅提高。CGMCC NO.1236620160419CGMCC NO.4.353420070401
【專利說明】
廈門霉素高產菌株及其培養基、用途
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種廈門霉素高產菌株及其培養基、用途。
【背景技術】
[0002] Streptomyces xiamenensis的模式菌株CGMCC Νο·4·3534分離自中國福建省紅樹 林環境樣本。該菌株產生的廈門霉素為具有氨基酸取代和異戊烯基化的苯并吡喃化合物， 具有抑制肺纖維化和瘢痕增生的生物活性，是新的抗纖維化藥物候選物。在通常采用的GYM (Glucose Yeast-extract Maltose)培養基中，野生型廈門鏈霉菌中廈門霉素的產量僅為 15mg/L。為滿足進一步的藥理活性研究和藥物開發的需求，廈門霉素的產量亟待提高。
[0003] 廈門霉素的生物合成途徑已被完全解析，克隆到的生物合成基因簇包括ximA-E這 5個基因，分別負責催化由分支酸裂解形成4-羥基苯甲酸，經過異戊烯基轉移、環化形成廈 門霉素 B，以及加載L-蘇氨酸形成終產物廈門霉素的過程。廈門霉素生物合成途徑相對簡 單，合成所需的前體均來自于微生物普遍存在的主代謝途徑(TCA、PPP、MEP等）。基于廈門霉 素生物合成途徑對出發菌株進行定向分子育種，有望快速構建高產菌株。培養基成分和培 養條件是影響菌體生長和發酵產素效率的重要因素，對相關因素進行優化是提高化合物產 量的傳統方法。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種廈門霉素生物合成基因簇加倍的廈門霉素高產菌株 及其培養基、用途。本發明在廈門鏈霉菌野生株基因組的核心區通過位點特異性整合導入 額外的廈門霉素生物合成基因簇，將廈門鏈霉菌中的生物合成基因簇進行加倍，獲得了具 有高產性狀的基因工程菌株廈門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)318Plsl CGMCC No. 12366。通過培養條件優化、單因素添加和正交實驗，確定了廈門霉素搖瓶發酵的優化培 養基。本發明提供的菌株和培養基配方具有廈門霉素產量大幅提高的有益效果。
[0005] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0006] 第一方面，本發明涉及一種廈門鏈霉菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株為廈 門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)318Plsl CGMCC No. 12366。
[0007] 優選的，所述基因工程菌株是通過位點特異性整合將廈門霉素生物合成基因簇在 野生型廈門鏈霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No · 4· 3534中進行加倍而獲得的。
[0008] 優選地，所述廈門霉素生物合成基因簇位于整合型質粒PLM009404上，將該質粒通 過大腸桿菌-鏈霉菌之間的接合轉移，可實現廈門霉素生物合成基因簇在野生型廈門鏈霉 菌中的加倍，獲得高產廈門霉素的基因工程菌株（Streptomyces xiamenensis)318P1 si CGMCC No.12366。
[0009] 更優選的，人工導入的廈門霉素生物合成基因簇位于基因組的核心區，并同時保 留了基因組臂區的原始生物合成基因簇。
[0010] 第二方面，本發明涉及前述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株的培養基，每升培養基 中含有葡萄糖20g、KN〇3lg、酵母浸膏10g、麥芽浸膏15g。
[0011]第三方面，本發明涉及一種前述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株在生產廈門霉素中 的用途。
[0012]優選的，所述基因工程菌株選用上述的培養基，經發酵培養獲得廈門霉素。
[0013] 優選的，所述基因工程菌株采用搖瓶培養生產廈門霉素;所述搖瓶培養生產條件 為：
[0014] 種子活化:在固體培養基SFM(豆餅粉20g/L，甘露醇20g/L，瓊脂20g/L)平板上挑取 產孢良好的單菌落，接種于500mL三角瓶內100mL種子活化培養基TSB(Tryptone Soya Broth 30. lg/L)中，3(TC，220r/min，培養48h;
[0015] 發酵培養:500ml三角瓶，裝液量100mL，按5%接種量(V/V)接種于如權利要求4所 述的發酵培養基，30°C，220r/min旋轉式搖床震蕩培養7天。
[0016] 本發明中，所述產生菌-廈門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)318Plsl已于 2016年4月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址 為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，菌種保藏編號為CGMCC No.12366。
[0017] 野生型廈門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)已于2007年4月保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院 3號，中國科學院微生物研究所，菌種保藏編號為CGMCC No.4.3534。
[0018] 本發明具有的有益效果為:通過提供一種廈門霉素生物合成基因簇加倍的高產基 因工程菌株及其優選的培養基配方和搖瓶培養條件，廈門霉素的產量獲得了大幅提高。
【附圖說明】
[0019] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、 目的和優點將會變得更明顯：
[0020] 圖1為廈門霉素生物合成基因簇加倍菌株318P1S1的PCR驗證;其中，A為整合位點 attL的PCR鑒定，B為pLM009404上xim基因上游重組序列的PCR鑒定，C為pLM009404上xim基 因下游重組序列的PCR鑒定，M:lKb DNAmaker;l:318: :pSET152的PCR產物；2:318Plsl的PCR 產物;3:318WT陰性對照；
[0021] 圖2為基因簇加倍菌株318P1S1培養基優化正交實驗中廈門霉素產量；
[0022]圖3為廈門霉素 HPLC檢測標準曲線；
[0023]圖4為基因簇加倍菌株318P1 s 1的廈門霉素產量(圖4A)和HPLC譜圖（圖4B)。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域 的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普 通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干調整和改進。這些都屬于 本發明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照 制造廠商所建議的條件。
[0025] 實施例1、廈門霉素生物合成基因簇加倍菌株的構建和驗證
[0026] 步驟一、大腸桿菌與鏈霉菌的接合轉移
[0027] 將E.coli ET12567(pUZ8002)單菌落在 10mL LB(加 Chl，Kana)培養基中37°C振 蕩培養過夜；
[0028] 取100yL過夜培養物接種至10mL新鮮的LB(加 Chl，Kana)培養基，37°C培養4~ 6h，至 0D600 = 0.4;
[0029] 用10mL新鮮LB培養基洗滌上述菌體2次以除去抗生素，將剩余的菌體懸浮于lmL LB培養基中；
[0030] 同時，取lmL(10-8)鏈霉菌孢子（No.4.3534)至5mLTES緩沖液中，50°C熱激 10min，冷卻；加入5mL 2XYT broth，37°C，200rpm培養2h;
[0031] 將lmL E.coli ET12567(pUZ8002)細胞和萌發后的鏈霉菌孢子混合，簡單離心， 棄去大部分上清，將剩余約50yL液體懸浮沉淀；
[0032] 依次稀釋至ΠΓ1~10_3倍，每個稀釋度取100yL涂布于SFM固體培養基，30°C培養 16~20h;
[0033] 用lmL含有25mg/mL萘啶酮酸和30mg/mL阿泊拉抗生素的無菌水覆蓋平板，30°C 繼續培養至出現單菌落；
[0034] 將平板上長出的單菌落每板挑取10個劃線于SFM(Apr)平板上轉接兩次培養，進 行PCR驗證，選出轉化成功的重組子。
[0035] 步驟二、對阿泊拉霉素抗性的整合子純化后進行PCR驗證
[0036] 首先用引物Pls-attF/R擴增整合位點attL的序列，PCR擴增產物大小與目標條 帶1Kb相符，證實PSET152質粒成功整合進318染色體中（圖1-A)。其次，分別用引物Pls-M13A-F/R和PI s-Ml 3E-F/R，擴增重組質粒pLM009404中xim基因簇前后端的重組序列，PCR擴 增產物大小與預期的目標條帶2.2Kb和2.3Kb相符，證實質粒攜帶的第二個xim基因簇成功 整合進318染色體中（圖1-B，1-C)。
[0037] PCR反應體系： 薇 DMA ( 100ng/'uL.) 0·5() μL」 2x PCR Mix (生工生物） 12.5pL
[0038] 正向及反向引物 0,50 μL DMSO 0.75 μL d.d.H20 up to 25 [iL
[0039] PCR反應程序：
[0041 ] 用于檢測接合轉移突變株ET12567/pSET152中導入的整合型質粒pSET152上 Apramycin抗性基因的引物：
[0044]用于檢測廈門霉素基因簇(xim)加倍菌株318Plsl及整合空載質粒的菌株318:: PSET152上游重組位點attL的引物：
[0047]用于檢測廈門霉素基因簇(xim)加倍菌株318Plsl基因組上整合質粒pLM009404攜 帶xim基因簇的引物：
[0052] 步驟三、電泳檢測PCR產物：120V，電泳30min后，用新鮮Gel Red染液染色40min， 紫外檢測目標條帶，圖1。
[0053] 步驟四、對目標條帶進行膠回收，連接至PMD-18T載體中，送公司測序，序列比對 后篩選出構建成功的重組菌株。
[0054] 本發明將廈門霉素基因簇加倍構建過表達菌株（Streptomyces xiamenensis) 318?181061〇：如.12366的目的是提高廈門霉素產量，以得到高產的廈門霉素突變株。此 外，由于廈門霉素基因簇位于318染色體左臂區的一個基因島上，存在遺傳不穩定性，其基 因組核心區序列中帶有0C31噬菌體特異性整合位點attB，通過特異性位點整合將另一個 廈門霉素基因簇引入到核心區，增加了基因簇拷貝數的同時也增加了遺傳穩定性，有利于 在此菌株的基礎上后續基因工程菌株(加強啟動子、刪除負調控等)的構建。
[0055] 實施例2、廈門鏈霉菌發酵條件優化
[0056] 步驟一，設計單因素實驗，分別就發酵過程中，搖瓶內是否加彈簧、消泡劑，培養 溫度：30°C、37 °C，搖床轉速：180r/min、220r/min、300r/min，種子活化時間：24h、36h、48h， 接種量2%、5%、10%，進行了單因素實驗；
[0057] 步驟二，觀察發酵7天內，菌株生長情況、菌絲體斷裂情況、搖瓶狀態，并記錄；
[0058] 步驟三，發酵7天后，收菌，提取廈門霉素并進行HPLC檢測，三個平行實驗組，取 平均值；
[0059] 步驟四，綜合菌體生長及產素結果，總結最適培養條件為：
[0060] _a.種子活化:500mL三角瓶，裝液量100mL，挑取產孢良好的單菌落，接種于種子 活化培養基TSB(Tryptone Soya Broth 30.1 g/L，pH 7.2)中，30°C，220r/min，培養48h; [00611 _b.發酵培養:500mL三角瓶，裝液量100mL，以5%接種量(V/V)接種于GYM發酵培 養基（葡萄糖4g/L，酵母浸膏4g/L，麥芽浸膏10g/L，pH 7.2)，30 °C，220r/min旋轉式搖床震 蕩培養7天，搖瓶中需加彈簧，不加消泡劑。
[0062]實施例3、廈門霉素生物合成培養基優化
[0063] 步驟一，使用L9(34)表進行4因素 3水平的正交實驗設計（表1)，通過調整GYM培 養基中4種原料的配比，得到9種培養基的配方(表2);
[0064] 步驟二，采用上述優化后的培養方法對318Plsl菌株進行了發酵培養基的優化 篩選，以廈門霉素終產量為研究指標。每個實驗組重復三次；
[0065] 步驟三，對抽提后的發酵產物進行高效液相色譜分析，結合極差和方差分析法 評價發酵條件優化組合和顯著性水平(圖2);
[0066] 步驟四，優選出廈門霉素高產培養基GYM-9(葡萄糖20g/L，酵母浸膏10g/L，麥芽 浸膏15g/L，KN03lg/L，pH 7.2)，其廈門霉素產量可達76mg/L。比較318野生株、空載菌株和 加倍菌株318Plsl在GYM培養基和優選出的GYM-9中的產量，3菌株在GYM-9中產量均提高2倍 多（圖4)。此外，基因簇加倍菌株318P1 s 1無論在GYM培養基還是在優選出的GYM-9培養基中， 廈門霉素產量都相較野生株增加2.5倍左右。
[0069] 實施例4、廈門霉素產量的HPLC定量分析方法
[0070] 步驟一，廈門霉素濃度標準曲線的繪制：將廈門霉素標準品稀釋成7個濃度梯 度，進行HPLC進樣檢測，各濃度對應峰面積數據如下：
[0072] 得出標準曲線（圖3)公式:y=14831812.72x-39728.96，R2 = l，y峰面積，x 廈門 霉素濃度；
[0073] 步驟二，廈門霉素產物提取方法:將100mL發酵液用等體積乙酸乙酯浸泡過夜， 重復萃取3次，上層有機相合并蒸干，浸膏溶于6mL甲醇；
[0074] 步驟三，HPLC檢測方法:將上述甲醇溶解浸膏稀釋3倍后，按照進樣量10yL進行 高效液相色譜(HPLC)分析，檢測條件為:C18反相柱(Agilent Extend-C18,4.6 X 150mm，5y m);流動相為分別加入0.5%三氟乙酸的甲醇和水(20%-80%梯度洗脫）；流速lmL/min;柱 溫為40°C ;紫外檢測波長254nm;
[0075] 步驟四，廈門霉素產量分析方法:采用標準廈門霉素濃度曲線公式，將檢測出的 峰面積，換算成相應廈門霉素濃度，乘以稀釋倍數，計算出廈門霉素產量。
[0076] 以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上 述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不 影響本發明的實質內容。
【主權項】
1. 一種廈門鏈霉菌的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株為廈門鏈霉菌 (Streptomyces xiamenensis)318Plsl CGMCC No.12366。2. 如權利要求1所述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是 通過位點特異性整合將廈門霉素生物合成基因簇在野生型廈門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.4.3534中進行加倍而獲得的。3. 如權利要求2所述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株，其特征在于，人工導入的廈門霉素 生物合成基因簇位于基因組的核心區，并同時保留了基因組臂區的原始生物合成基因簇。4. 一種如權利要求1所述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株的培養基，其特征在于，每升培 養基中含有葡萄糖20g、KN〇3 lg、酵母浸膏10g、麥芽浸膏15g。5. -種如權利要求1所述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株在生產廈門霉素中的用途。6. 如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌株選用如權利要求4所述的 培養基，經發酵培養獲得廈門霉素。7. 如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌株采用搖瓶培養生產廈門霉 素;所述搖瓶培養生產條件為： 種子活化：在固體培養基SFM平板上挑取產孢良好的單菌落，接種于500mL三角瓶內 100mL種子活化培養基TSB中，30°C，220r/min，培養48h; 發酵培養:500mL三角瓶，裝液量100mL，按體積比5 %的接種量接種于如權利要求4所述 的發酵培養基，30°C，220r/min旋轉式搖床震蕩培養7天。
【文檔編號】C12N1/21GK105969714SQ201610362606
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】徐俊, 胡曉艷, 徐岷涓, 步緒亮, 余河霖
【申請人】上海交通大學