一種靈芝酸高產工程菌株kmust-Crz的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種靈芝酸高產工程菌株kmust?Crz，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC NO.12235本發明提供的靈芝工程菌，是通過選用靈芝強啟動子P?gpd表達鈣離子依賴的鋅指蛋白調控因子Crz基因，得到高產靈芝酸靈芝工程菌kmust?Crz；通過搖瓶發酵實驗表明，該菌在其細胞生長不受影響的情況下，Crz轉化子菌株產單體靈芝酸GA?Me，GA?T，GA?Mk，GA?S分別是WT菌株的3.1，3.2，2.1，3.6倍，因此，本高產菌株可以作為生產靈芝酸的工程菌株，具有廣泛的應用前景。CGMCC NO.1223520160321
【專利說明】
一種靈芝酸高產工程菌株kmust-Grz
技術領域
[0001]本發明屬于基因工程和代謝工程領域的，具體涉及一種通過基因工程在靈芝中表達I丐離子依賴的鋅指蛋白轉錄因子(Calcineurin-regulated zine-finger factor,Crz)基因的方法，構建了一個靈芝酸的高產工程菌株。
【背景技術】
[0002]靈芝(Ganodermalucidim )是擔子菌綱，多孔菌科，靈芝屬真菌。靈芝真菌在我國有20多種，包括赤芝，黃芝，紫芝，黑芝，薄蓋靈芝，樹舌等。我國應用靈芝作為藥物已有兩千多年的歷史。靈芝對于增強人體免疫力，調節血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護肝，促進睡眠等方面均具有顯著療效。由于其特殊的要用價值，靈芝的有效成分分析和藥理學研究已經引起了國際上的廣泛關注，尤其在日本，美國，韓國等國家。目前，靈芝的研究已經深入到了分子水平，一些專著相繼出版，從不同的角度介紹了靈芝的生物學特性、栽培技術、藥理學作用及臨床應用等情況。
[0003]靈芝酸是一類分子結構中含有羧基的三萜類物質，從結構來看它屬于高度氧化的羊毛留烷衍生物。自1982年Kubota T等人首次分離得到靈芝酸以來，目前已有130多種靈芝酸被分離出來。它們多為四環三萜類化合物，含有30個碳原子，結構中一般都有羥基，在IR中有較強的羥基吸收峰。在紫外光譜中也呈現多個波長的特征吸收，多數是在250 nm、237nm、365 nm處有吸收峰。靈芝酸具有許多重要的藥理活性如:抗癌，靈芝酸類物質能明顯抑制小鼠肝肉瘤(HTC )細胞的增殖;護肝，靈芝中的靈芝酸提取物能加強其解毒作用;抗HIV;降血壓;抗氧化;抑制血小板凝集，抑制組胺釋放，鎮痛，抑制真核細胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋白轉移酶活性和促進體液免疫功能等作用。
[0004]隨著人們生活水平的提高，各種疾病的發生率也逐年遞增。于是，人們對健康的關注也越來越來廣泛。靈芝酸作為靈芝中的重要活性成分，對提高人體免疫力，抗氧化等方面具有重要的地位，尤其是在治療癌癥方面表現尤為突出。
[0005]由于野生靈芝生長周期長，受環境因素影響大且野生靈芝資源有限，靈芝菌絲培養成為生產活性物質的重要方法。隨著對靈芝活性物質需求的不斷增加，如何提高靈芝的產量和增加靈芝的有效成分越來越引起人們的關注。液體深層發酵技術是進行快速工業化生產的重要手段。現在市售的靈芝酸主要是從靈芝子實體和液體深層發酵得到的菌絲體中獲得。由于野生靈芝液體深層發酵時靈芝酸在靈芝細胞中的含量較低，分離純化也較難，限制了靈芝酸的活性及作用機理研究及其廣泛應用。近年來，基因工程與代謝工程迅速發展，成為了現代分子育種的重要手段。通過分子克隆和基因拼接等分子生物學方法來改造菌株的基因組，從而提高活性成分的含量越來越受學者們的青睞。
[0006]靈芝酸合成途徑首先是由乙酰輔酶A ( Acetyl CoA )在硫解酶(AcetoacetylCoA th1lase )催化下縮合形成乙酰乙酰輔酶A ( Acetoacetyl CoA )，乙酰乙酰輔酶A經HMG-CoA合成酶(HMG-CoA synthase )催化與另一分子乙酰CoA縮合生成3-輕基-3甲基-戊二酸單酰輔酶A ( HMG-CoA )，然后HMG-CoA還原酶(HMG-CoA reductase, HMGR )催化HMG-CoA轉化為甲羥戊酸。甲羥戊酸經甲羥戊酸激酶(MVK )、甲羥戊酸5-磷酸激酶(PMK )和MDD三步酶促反應轉化為IPP JPP進一步轉化成法呢酯焦磷酸FPP JPP在鯊烯合酶squalene synthase ( SQS )的催化下合成藍稀SQS后經過藍稀單加氧酶的作用產生鯊烯2，3-氧化物，再經過羊毛留醇合酶(LS )的作用產生羊毛留醇。羊毛留醇又經過一系列氧化還原反應生成靈芝酸。
[0007]鈣調磷脂酶信號是重要的鈣離子信號之一。Crz是鈣調磷酸酶信號途徑上的一個可以被激活的轉錄因子。轉錄因子Crz上有一個鋅指序列，可以結合DNA，并且特異性地結合到鈣調磷脂酶依賴的反應原件CDRZ上。鈣調磷脂酶通過對細胞質內的轉錄因子Crz去磷酸化使Crz快速地從細胞質轉移到細胞核，從而促進相關基因的表達，進而對次級代謝物的生物合成進行調控。
[0008]我們以前通過比較轉錄組的方法篩選了靈芝酸高產(液體靜置培養)/低產(液體震蕩培養)培養條件下差異表達的基因，發現Crz基因在靈芝酸高產條件下有顯著地上調。早期的研究表明在靈芝細胞液體靜置培養過程中外源添加鈣離子能顯著提高菌絲體中靈芝酸的含量，添加鈣離子同時誘導了靈芝酸生物合成基因HMGR，SQS, LS的高表達，鈣離子信號傳導途徑上Crz基因的高表達。以上結果表明靈芝酸的高產可能與Crz基因的過量表達相關。因此，對Crz基因進行過量表達有可能會提高靈芝細胞生產靈芝酸的能力。
[0009]在本研究中，我們率先在靈芝細胞中高表達了靈芝的Crz基因，獲得了Crz基因過量表達的靈芝工程菌株，工程菌株生產靈芝酸的水平有顯著提高。
【發明內容】
[0010]本發明的目的是解決野生型靈芝菌株自身產靈芝酸較低的問題，提供一種靈芝酸高產菌株，該菌株為高產靈芝酸的靈芝(Ganodenm Iucidum )工程菌kmust-Crz，已于2016年3月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.12235。
[0011]本發明靈芝酸高產工程菌株的構建方法如下:
以PMD19-T為起始載體并使用靈芝本身的強啟動子P-gpc/、終止子基因，cbx基因(具有carboxin抗性)是來自靈芝本身的抗性基因，其特點是在蘑菇類擔子菌的轉化體系中同源標記基因的轉化效率更高，能夠穩定遺傳，抗性強。
[0012]1、將靈芝啟動子P-斯c/與終止子T-SC/A5與PMDl9-T連接，將靈芝抗性基因插入到Λ? I酶切位點，從而構建成PJW-EXP載體;其具有靈芝的強啟動子和終止子，并具有靈芝本身的抗性；
其中擴增靈芝強啟動子P-^w/的引物序列為:
?-gpd -F:5，-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3，，
?-gpd -R:5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG- 3’；
擴增靈芝基因終止子的引物序列為:
?-sdhB -F: 5，-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3，，
?-sdhB -R: 5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3’；
擴增靈芝ck抗性基因的引物為:
cbx -F:5’-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3’，cbx -R:5，-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3,；2、靈芝的Crz基因從靈芝基因組中克隆(所用的引物為Crz-Nhe-F和Crz-Sma-R )， 并插入到PJW-EXP載體中，得到pJW-EXP-Crz載體；引物序列為:Crz-Nhe-F:5，-ATGGAAGACCGCAGTGCGT- 3，Crz-Sma-R:5，-TCAGCTTGTCGCGCTCCGA- 3，；3、通過PEG介導原生質體融合的方法，將pJW-EXP-Crz轉化到野生型靈芝細胞中，以 carboxin作為抗性來篩選靈芝轉化子，在含有carboxin抗性的CYM平板上篩選出轉化子；4、將轉化子在carboxin抗性的CYM平板中進行傳代培養；5、靈芝細胞的液體培養:PDA培養基(g/L ):葡萄糖10,瓊脂20，硫酸鎂1.5，磷酸二氫鉀3,維生素B1 0.05 和制備好的土豆汁；土豆汁的制備方法:將200 g去皮新鮮土豆切成小塊，加入去離子水1.0 L煮沸30 min， 用八層紗布過濾，取濾液，用于PDA培養基的配制；種子培養基(g/L ):葡萄糖35,蛋白胨5,酵母膏2.5,磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5和維生素B1 0.05。[〇〇13]發酵培養基(g/L ):蛋白胨5、酵母膏5、磷酸二氫鉀1.0、硫酸鎂0.5、維生素B1 0.05,乳糖35,起始pH 5.5。[〇〇14] CYM培養基(g/L ):葡萄糖20,麥芽糖10,酵母粉2,蛋白胨2，MgS〇4 0.5，KH2P〇4 4.6,瓊脂 10。[〇〇15]斜面培養:接種菌絲于土豆汁-葡萄糖-瓊脂(PDA )斜面中28°C培養5-7天。 [〇〇16] 一級種子培養:在250 mL搖瓶中添加40 mL培養基和10 mL菌絲體懸液(從一支斜面中獲得)，并在30 °C，120 rpm下培養5天。[0〇17] 二級種子培養:在250 mL搖瓶中加入45 mL培養基和5 mL—級種子培養液(大約 500 mg DW/L，一級培養物用玻璃珠打碎后接種)，在30°C，120 rpm下培養2天。[0〇18] 發酵培養:在250 mL搖瓶中加入45 mL發酵培養基和5 mL二級種子發酵液(大約 500?600 mg DW/L，二級培養物用玻璃珠打碎后接種)，在30°C，120 rpm下培養。[〇〇19] 6、單體靈芝酸的分離和提取準確稱取干細胞粉末100 mg，加入3 mL 70%(v/v)乙醇浸泡過夜，超聲處理3次，每次30 mirulOOOO rpm離心5 min后獲得上清液。在50°C烘箱中烘干。用200yL色譜級甲醇徹底溶解，用0.22mi濾膜過濾。用HPLC檢測靈芝酸單體。HPLC檢測條件為:HPLC色譜柱為C18柱 (Agilent 1200 series，5 ym Agilent Zorbax SB-C18 column，250X4.6 mm);進樣量 20 此;流速1 mL/min;流動相A為甲醇/乙酸(100:0.5(v/v))，流動相B為超純水，0-20 min:A 相為80 %-100 %等梯度洗脫;20 min-30 min:A相為 100 %洗脫;30 min-35 min:A相為80 % 洗脫;紫外檢測波長為245 nm;洗脫時間35 min。記錄相應的峰面積和出峰時間。按照標準曲線計算出各個靈芝酸單體的濃度和含量。
[0020]本發明的優點和技術效果:通過搖瓶發酵實驗表明，該靈芝酸高產工程菌株在其發酵性能不受影響的情況下(培養溫度、培養基組成、接種量和培養方式相同的條件下)， Crz轉化子菌株產單體靈芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S分別是WT菌株的3.1，3.2,2.1，3.6 倍，在同等情況下，使用本發明構建的工程菌株可以節約勞動力，縮短生產周期，降低成產成本。因此，本高產菌株可以作為生產靈芝酸的工程菌株，適用于工業化生產，具有廣泛的應用前景。【附圖說明】
[0021]圖1為本發明中靈芝基因組；圖中:G為靈芝基因組，M為DNA Marker;圖2為本發明中pJW-EXP載體結構示意圖；圖3為本發明中擴增Crz基因的電泳圖；圖中:M為DL10000的核酸標準品(Takara ); C為Crz基因；圖4為本發明中pJW-EXP-Crz載體結構示意圖；圖5為本發明中驗證Crz陽性轉化子的電泳圖；圖中:M為DL2000的核酸標準品( Takara )，C為轉Crz基因的陽性轉化子，WT為野生型菌株，N為陰性對照，P為pJW-EXP-Crz 質粒。【具體實施方式】
[0022]下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的內容并不局限于此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規試劑或按常規方法配置的試劑。[〇〇23]實施例1: pJW-EXP載體的構建 1、靈芝基因組DNA的提取稱取約0.2 g凍干野生型靈芝(CCGMC 5.0616 )的菌絲體在液氮中研磨成粉末，將粉末轉入1.5 mL經65°C預熱的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)抽取緩沖液中，65°C保溫 30 min，然后在4°C下，10000 g離心20min，取上清液加等體積的氯仿:異戊醇(24:1 ) 的混合物，輕輕搖勾30 min以上，4°C下、10000 g離心20min;將上清液移入1.5 mL離心管后，加入2/3體積經-20 °C預冷的異丙醇，輕輕搖動5min，用玻璃棒撈出DNA后，用75%的乙醇洗滌2-3次，室溫涼干后，溶于適量含20g/mL RNase的TE，37°C消化RNA 30 min后即可到靈芝基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:靈芝的基因組為單一條帶，且大小在lOOOObp以上 (見圖1)。[〇〇24]2、靈芝強啟動子的克隆以靈芝基因組DNA為模板，用P-聊/ -F、P-聊/ -R作為引物進行PCR擴增，擴增得到靈芝的啟動子P-gpc/，引物序列如下:P-仰￠/ -F:5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3’，?-gpd -R:5，-GCTAGCGTTGAGAGGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG-3,；PCR條件如下:95°C lOmin，95°C 30s，55°C 30s，72°C 90s，72°C lOmin。
[0025]3、啟動子 P-gpc/與 PMD19-T 連接將克隆后的啟動子P-gpc/進行膠回收，將回收產物與PMD19-T用T4連接酶在16°C進行連接，得到PMD19-T-P中間載體。[〇〇26]4、靈芝終止子的克隆以靈芝基因組DNA為模板，用引物 T-sc/M -F:5，-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3，1-sdhB -R:5'-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3'進行擴增，得到2480bp的序列；PCR條件為:95°C lOmin，95°C 30s，55°C 30s，72°C 150s，72°C lOmin。
[0027]5、終止子與PMD19-T-P連接將克隆后的終止子T-sd/沿膠回收，把PMD19-T-P中間載體用SacI單酶切，PCR回收酶切產物，再用T4聚合酶補平酶切位點，然后再用T4連接酶在16°C進行平末端連接，得到PMD19-T-P-T中間載體。
[0028]基因的克隆以靈芝基因組DNA為模板，用引物cbx -F:5'-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3'-R:5’-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3’ 進行PCR得到靈芝的基因；PCR條件為:95°C lOmin，95°C 30s，55°C 30s，72°C 90s，72°C lOmin;再設計一對定點突變引物:sc*5-MR:5’-GAAGATCGTG4GGCAGCGGTATAGGC-3’(其中&為突變位點)-MF: 5 ’ -GCCTATACCGCTGCCICACGATCTTC-3 ’(其中I為突變位點)。
[0029]第一輪PCR用引物-F和sc/M -MR進行擴增，PCR條件為:95°C lOmin，95°C 30s，58°C 30s，72°C 2min20s，72°C lOmin，得到片段第二輪PCR用引物和 sc/A5-MF 進行擴增，PCR 條件為:95°C lOmin，95°C 30s，55°C 30s，72°C lmin20s，72°C lOmin，得到片段獲得相應片段后，采用重疊PCR的方法把兩個片段連接。第三輪重疊 PCR的引物為C&-F和c如-R，擴增條件為:94 °C變性10 min，66 °C退火30s，72 °C延伸4 min，共35個循環，最后72 °C延伸10 min。最終獲得了3171 bp突變的靈芝sc//出基因序列( 定點突變后對carboxin抗生素產生抗性，我們把定點突變后的sc/Aj?基因定義為)。經序列測定后確認相應位點已經突變。
[0030] 7、將突變的基因插入到PMD19-T-P-T的Pst頂每切位點將PMD19-T-P-T載體用Pst I酶在37°C下，單酶切2h，回收酶切后的片段，用T4聚合酶補平酶切位點，再用T4連接酶在16°(:下把^&基因與回收后的片段進行連接，即得到pJW-EXP 載體(見圖2 )。[〇〇31] 實施例2:pJW-EXP-Crz載體的構建 l、Crz基因的克隆以靈芝基因組DNA為模板，用引物 Crz-Nhe-F:5，-ATGGAAGACCGCAGTGCGT- 3，Crz-Sma-R:5，-TCAGCTTGTCGCGCTCCGA- 3，進行PCR得到Crz基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，編碼如SEQ ID N0:2所示的鈣離子依賴的鋅指蛋白調控因子;PCR條件為:95°C lOmin，95°C 30s，60°C 30s，72°C 150s，72°C lOmin (見圖3 )。[〇〇32]2、將Crz基因插入到pJW-EXP載體將p JW-EXP載體用Sma I和Nhe I雙酶切，回收酶切后的片段，用T4連接酶在16 °C下，將Cr z 基因插入到pJW-EXP載體的Nhel和Smal之間即得到pJW-EXP-Crz載體(見圖4 )。[〇〇33]實施例3:通過PEG介導原生質體融合的方法，將pJW-EXP-Crz轉化到野生型靈芝細胞中1、靈芝原生質體的制備及轉化先用溶壁酶將野生型靈芝菌絲制備成原生質體，然后將靈芝原生質體懸浮在l〇〇yL的 STC ( 0.55 M的山梨醇，10 mM的CaCl2，10 mM的Tris-HCl緩沖液，pH為7.5 )中，再加入ly g的質粒DNA和PTC緩沖液(60%的PEG4000 ( W/V )，10 mM的Tris-HCl緩沖液，pH為7.5， 50 mM的CaCl2 );在冰上培養lOmin，再加入lmL的PTC緩沖液混合均勻并在室溫培養 20min;用10mL融化的CYM固體培養基與轉化后的原生質體混合倒平板并加入carboxin使 carboxin的終濃度為2 mg/L;在30°C下培養10天后可長出若干單菌落。[〇〇34]2、在含有carboxin抗性的平板上傳代培養把單菌落轉移到含有2 mg/L的carboxin的CYM平板中，在30°C下傳代培養約7天;經過3 次在抗性平板上傳代可獲得穩定的轉化子，用CTAB法提取轉化后的靈芝基因組，具體操作步驟見實施例1步驟1。分別以轉化后的靈芝基因組、野生型(WT )靈芝基因組、水(陰性對照)為模板，用Crz-F:5，-GAGTGACGCAGGTGGTGA- 3，Crz-R:5，-TAGGAATGGGGAGAAGGA- 3，作為驗證引物進行PCR，PCR條件為:95°C 10min，95°C 30s，60°C 30s，72°C90s，72°C lOmin (見圖5 )。以Crz-F和Crz-R為引物和基因組DNA為模板進行PCR，能夠擴增出約 1393bp條帶的菌株即可認為是導入了 Crz基因的轉基因靈芝。如圖5所示，從轉基因菌株上能夠擴增出約1393bp的條帶，而野生型中沒有出現此條帶，只出現了一些非特異性條帶。結果表明:Crz基因確實整合到了靈芝基因組上。
[0035]3、斜面培養將陽性轉化子轉移到固體roA培養基中(含有2 mg/L的carboxin )，在28°C下培養 5-7 天。[〇〇36]4、一級種子培養在250 mL搖瓶中添加40 mL種子培養基和10 mL菌絲體懸液(從一支斜面中獲得)， 并在28°C，120 rpm下培養5天。[〇〇37]5、二級種子培養在250 mL搖瓶中加入45 mL種子培養基和5 mL—級種子培養液(大約500 mg DW/L， 一級培養物用玻璃珠打碎后接種)，在28°C，120 rpm下培養2天。[〇〇38]6、發酵培養在250 mL搖瓶中加入45 mL發酵培養基和5 mL二級種子發酵液(大約500?600 mg DW/L，二級培養物用玻璃珠打碎后接種)，在28°C，120 rpm下培養。[〇〇39]7、單體靈芝酸的分離和提取準確稱取干細胞粉末100 mg，加入3 mL 70%(v/v)乙醇浸泡過夜，超聲處理3次，每次30 mirulOOOO rpm離心5 min后獲得上清液。在50°C烘箱中烘干。用200yL色譜級甲醇徹底溶解，用0.22mi濾膜過濾。用HPLC檢測靈芝酸單體。HPLC檢測條件為:HPLC色譜柱為C18柱 (Agilent 1200 series，5 ym Agilent Zorbax SB-C18 column，250X4.6 mm);進樣量 20 此;流速1 mL/min;流動相A為甲醇/乙酸(100:0.5(v/v))，流動相B為超純水，0-20 min:A 相為80 %-100 %等梯度洗脫;20 min-30 min:A相為 100 %洗脫;30 min-35 min:A相為80 %洗脫;紫外檢測波長為245 nm;洗脫時間35 min。記錄相應的峰面積和出峰時間。
[0040]通過野生型和Crz菌株靈芝酸的含量的測定，結果表明:通過搖瓶發酵實驗表明， 該菌在其發酵性能不受影響的情況下，Crz轉化子菌株產單體靈芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk， GA-S分別是WT菌株的3.1，3.7，2.9，3.6倍，因此，本高產菌株可以作為生產靈芝酸的工程菌株，具有廣泛的應用前景。
【主權項】
1.一種靈芝酸高產工程菌株kmust-Crz，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.12235。
【文檔編號】C12R1/645GK106010989SQ201610342738
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月23日
【發明人】徐軍偉, 姜露熙, 張德懷, 李煥軍, 岳同輝, 李娜
【申請人】昆明理工大學