專利名稱：利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法
技術領域：
本發明屬于線蟲病防治技術領域，尤其涉及一種利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法。
背景技術：
松材線蟲病(Pine wild disease)是世界林木頭號病害,可引起松林成片枯萎死亡。自1982年傳入我國后，該病害在我國大江南北瘋狂肆虐。所到之處，松林一片枯黃。據不完全統計，我國每年病害發生面積約4000hm2，造成松樹死亡約15萬株以上，損失木材約5000m3，每年全國用于病害的防治經費亦達2. 2億元。我國對于松材線蟲病的研究盡管已持續了幾十年，但到目前為止仍然沒有找到能應用于生產，切實有效控制病害發展的防治方法。所以病害仍然在擴展，松林仍然在減少。目前世界上對松材線蟲病的防治還沒有有效的方法。目前使用的防治方法主要有①冬季砍除病死株，以減少初侵染來源。該方法缺點是砍伐不徹底，年年砍年年有發生，②樹干注射殺線蟲劑，以保護珍貴松樹。該方法的缺點是使用煩瑣，對樹木傷害較大。③用寄生昆蟲寄生傳媒昆蟲天牛，該方法的缺點是寄生昆蟲的飼養煩瑣，效果也一般。④利用天牛引誘劑引誘天牛，該方法效果一般。總之，這些方法雖然有一定效果，但都不能徹底解決松材線蟲病問題。
發明內容
本發明針對目前世界上對松材線蟲病的防治方法中存在的缺陷，如①冬季砍除病死株，以減少初侵染來源。該方法缺點是砍伐不徹底，年年砍年年有發生，②樹干注射殺線蟲劑，以保護珍貴松樹。該方法的缺點是使用煩瑣，對樹木傷害較大。③用寄生昆蟲寄生傳媒昆蟲天牛，該方法的缺點是寄生昆蟲的飼養煩瑣，效果也一般。④利用天牛引誘劑引誘天牛，該方法效果一般等，提出一種利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法。本發明實施例是這樣實現的，一種利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法，該方法包括把美國細菌懸浮液噴灑到林間，5月份噴霧一次，連續2年，共2次噴霧；在兩三年內美國細菌替代松材線蟲體表的致病菌，控制我國林間松材線蟲病的流行。 進一步，該方法進一步包括選擇供試木塊和線蟲蟲株；分離線蟲和細菌；制備細菌無細胞培養液；培養無菌組培苗；制備細菌與無菌線蟲懸浮液；測定細菌無細胞培養液毒力；
測定細菌與無菌線蟲混合懸浮液對松苗致病性；細菌野外控制釋放和野外替代能力檢測；對細菌液進行噴灑應用。進一步，所述選擇供試木塊和線蟲蟲株的方法為由美國進口的2個批次的木材包裝箱的供試木塊，供試無菌松材線蟲為中國浙江松材線蟲蟲株，參比細菌菌株為為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌；進一步，所述分離線蟲和細菌的方法為
采用貝爾曼漏斗法分離木塊中的線蟲，采用稀釋分離法分離線蟲體表的細菌。進一步，所述細菌無細胞培養液制備方法為細菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養基中，進行恒溫搖床振蕩培養，然后將細菌培養液裝入離心管內，進行高速冷凍離心機離心，取上清液用微孔濾膜的細菌過濾器過濾，得到細菌濾液。用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基檢驗是否帶菌，如帶菌，重復上述操作，直到得到細菌的無細胞培養液為止，置于冰箱中保存備用。進一步，所述無菌組培苗的培養實現方法為選取飽滿黑松種子，溫水處理，浸泡，使種子充分吸漲，去除不飽滿種子，然后用高錳酸鉀處理，流水沖洗。剝去外種皮，無菌條件下用乙醇浸泡，升汞處理，然后用滅菌水沖洗3遍，挑于1/2瓊脂的PDA培養基上，置于恒溫培養箱，暗培養催芽，最后把無菌發芽的種子移植到MS基本培養基上，光照條件下培養I 2個月備用。進一步，所述細菌與無菌線蟲懸浮液的制備方法為用劃線法純化細菌，挑細菌單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基里，恒溫搖床上震蕩培養，用牛肉膏蛋白胨液體培養基稀釋菌液，調制細菌懸浮液；用滅菌水洗下預先培養好的無菌線蟲，調整為10000條/mL線蟲懸浮液，并用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基檢驗線蟲研磨液是否帶菌。將線蟲懸浮液分別用滅過菌的離心管分裝，每管3mL，每個離心管中加入50 μ L任一細菌懸浮液，混合處理，中間不斷翻倒，使線蟲與細菌充分結合后，離心，除去上清，用滅菌水定容到3mL制成懸浮液，備用。進一步，所述細菌無細胞培養液毒力測定方法為在大廣口瓶內放入3個小青霉素瓶，周圍加水少量保濕，封口膜封口滅菌。在無菌條件下往每個小青霉素瓶內加入3mL細菌無細胞培養液，以滅菌水和牛肉膏蛋白胨液體培養基為對照。然后插入無菌黑松切根苗，每個小青霉素瓶一棵無菌苗，封口膜封瓶口，平放于光照培養箱內，光照條件下培養，觀察記錄萎蔫情況和萎蔫時間。進一步，所述細菌與無菌線蟲混合懸浮液對松苗致病性測定方法為在廣口瓶內放3個小青霉素瓶，每個小青霉素瓶加3ml水，封口膜封口滅菌。在無菌條件下往每個小青霉素瓶插一株切根組培苗，然后用無菌細針在無菌苗頂芽下兩片葉子處刺個傷口，并在傷口處附上一團無菌的脫脂小棉球，再往脫脂棉球上滴200 μ L細菌與線蟲混合懸浮液，并保證小棉球在24h內保持濕潤，每處理設3個重復，以單獨接種無菌線蟲、野生線蟲、滅菌水為對照，接種后將廣口瓶封口，培養箱內光照條件下培養，觀察記錄萎蔫情況，參照病害分級方法進行分級。進一步，所述生防菌野外控制釋放和野外替代能力檢測方法為從病區砍伐有天牛蛀洞的帶皮病死木，用紗網包裹并分成不同的處理。分別在樹皮表面噴灑美國細菌培養液。待天牛爬出洞7天后，收集紗網內的天牛，再分離天牛攜帶的松材線蟲。另外，采集松樹新鮮松枝，在針葉表面同樣噴灑美國細菌懸浮液。把林間收集的天牛放到針葉上喂食7天，收集天牛并分離天牛攜帶的線蟲。從天牛上分離的松材線蟲，灰葡萄孢培養繁殖后接種松苗，待I個月后觀察記錄松苗萎蔫情況。并分離松苗內的線蟲，再分離線蟲攜帶的細菌，根據各細菌菌落形態和后續的生化鑒定確定菌落種類，統計各目標菌株所占的比率。本發明提出的利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法，原理是利用松材線蟲體表細菌生態位的替換，利用從美國松材線蟲體壁上分離和篩選的細菌菌株進行生物防治。該方法是把生防細菌噴灑到林間，因為該細菌具有致病力低，繁殖和替代能力強等特點，可快速替代我國松林內松材線蟲體表的強致病細菌，使松材線蟲失去致病能力，從而 達到控制松材線蟲病流行的目的。該方法具有簡單易行，易于推廣應用，成本較低，效果好，作用徹底等優點。
圖I是本發明實施例提供的利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法的實現流程圖；圖2是本發明實施例I的具體實現流程圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。圖I示出了本發明實施例提供的利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法的實現流程。該方法主要包括以下步驟把美國細菌懸浮液噴灑到林間，5月份噴霧一次，連續2年，共2次噴霧；在兩三年內美國細菌替代松材線蟲體表的致病菌，控制我國林間松材線蟲病的流行。實施例I :本發明實施例提供的利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法的實現流程如圖2所示。具體詳述如下S201 :選擇材料。由美國進口的2個批次的木材包裝箱的供試木塊,供試無菌松材線蟲為中國浙江松材線蟲蟲株,參比細菌菌株為為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，由本實驗
室提供；S202:線蟲和細菌分離。采用貝爾曼漏斗法分離木塊中的線蟲，采用稀釋分離法分離線蟲體表的細菌。S203 :細菌無細胞培養液制備。細菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養基中，進行恒溫搖床振蕩培養，然后將細菌培養液裝入離心管內，進行高速冷凍離心機離心，取上清液用微孔濾膜的細菌過濾器過濾，得到細菌濾液。用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基檢驗是否帶菌，如帶菌，重復上述操作，直到得到細菌的無細胞培養液為止，置于冰箱中保存備用；S204 :無菌組培苗的培養。選取飽滿黑松種子，溫水處理，浸泡，使種子充分吸漲，去除不飽滿種子，然后用高錳酸鉀處理，流水沖洗。剝去外種皮，無菌條件下用乙醇浸泡，升汞處理，然后用滅菌水沖洗3遍，挑于1/2瓊脂的PDA培養基上，置于恒溫培養箱，暗培養催芽，最后把無菌發芽的種子移植到MS基本培養基上，光照條件下培養I 2個月備用；S205 :細菌與無菌線蟲懸浮液的制備。用劃線法純化細菌，挑細菌單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基里，恒溫搖床上震蕩培養，用牛肉膏蛋白胨液體培養基稀釋菌液，調制細菌懸浮液；用滅菌水洗下預先培養好的無菌線蟲，調整為10000條/mL線蟲懸浮液，并用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基檢驗線蟲研磨液是否帶菌。將線蟲懸浮液分別用滅過菌的離心管分 裝，每管3mL，每個離心管中加入50 μ L任一細菌懸浮液，混合處理，中間不斷翻倒，使線蟲與細菌充分結合后，離心，除去上清，用滅菌水定容到3mL制成懸浮液，備用；S206 :細菌無細胞培養液毒力測定。在大廣口瓶內放入3個小青霉素瓶，周圍加水少量保濕，封口膜封口滅菌。在無菌條件下往每個小青霉素瓶內加入3mL細菌無細胞培養液，以滅菌水和牛肉膏蛋白胨液體培養基為對照。然后插入無菌黑松切根苗，每個小青霉素瓶一棵無菌苗，封口膜封瓶口，平放于光照培養箱內，光照條件下培養，觀察記錄萎蔫情況和萎蔫時間。S207 :細菌與無菌線蟲混合懸浮液對松苗致病性測定。在廣口瓶內放3個小青霉素瓶，每個小青霉素瓶加3ml水，封口膜封口滅菌。在無菌條件下往每個小青霉素瓶插一株切根組培苗，然后用無菌細針在無菌苗頂芽下兩片葉子處刺個傷口，并在傷口處附上一團無菌的脫脂小棉球(能吸附200 300 μ L懸浮液)，再往脫脂棉球上滴200 μ L細菌與線蟲混合懸浮液，并保證小棉球在24h內保持濕潤，每處理設3個重復，以單獨接種無菌線蟲、野生線蟲、滅菌水為對照，接種后將廣口瓶封口，培養箱內光照條件下培養，觀察記錄萎蔫情況，參照病害分級方法進行分級。S208 :細菌野外控制釋放和野外替代能力檢測。從病區砍伐有天牛蛀洞的帶皮病死木，用紗網包裹并分成不同的處理。分別在樹皮表面噴灑美國細菌培養液。待天牛爬出洞7天后，收集紗網內的天牛，再分離天牛攜帶的松材線蟲。另外，采集松樹新鮮松枝，在針葉表面同樣噴灑美國細菌懸浮液。把林間收集的天牛放到針葉上喂食7天，收集天牛并分離天牛攜帶的線蟲。從天牛上分離的松材線蟲，灰葡萄孢培養繁殖后接種松苗，待I個月后觀察記錄松苗萎蔫情況。并分離松苗內的線蟲，再分離線蟲攜帶的細菌，根據各細菌菌落形態和后續的生化鑒定確定菌落種類，統計各目標菌株所占的比率。S209 :細菌液噴灑應用。把生防細菌噴灑到林間，因為該細菌具有致病力低，繁殖和替代能力強等特點，可快速替代我國松林內松材線蟲體表的強致病細菌，使松材線蟲失去致病能力，從而達到控制松材線蟲病流行的目的。本發明實施例提出的利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法，原理是利用松材線蟲體表細菌生態位的替換，利用從美國松材線蟲體壁上分離和篩選的細菌菌株進行生物防治。該方法是把生防細菌噴灑到林間，因為該細菌具有致病力低，繁殖和替代能力強等特點，可快速替代我國松林內松材線蟲體表的強致病細菌，使松材線蟲失去致病能力，從而達到控制松材線蟲病流行的目的。該方法具有簡單易行，易于推廣應用，成本較低，效果好，作用徹底等 優點。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法，其特征在于，該方法包括 把美國細菌懸浮液噴灑到林間，5月份噴霧一次，連續2年，共2次噴霧； 在兩三年內美國細菌替代松材線蟲體表的致病菌，控制我國林間松材線蟲病的流行。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，該方法進一步包括 選擇供試木塊和線蟲蟲株； 分離線蟲和細菌； 制備細菌無細胞培養液； 培養無菌組培苗； 制備細菌與無菌線蟲懸浮液； 測定細菌無細胞培養液毒力； 測定細菌與無菌線蟲混合懸浮液對松苗致病性； 細菌野外控制釋放和野外替代能力檢測； 對細菌液進行噴灑應用。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述選擇供試木塊和線蟲蟲株的方法為 由美國進口的2個批次的木材包裝箱的供試木塊，供試無菌松材線蟲為中國浙江松材線蟲蟲株，參比細菌菌株為為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述分離線蟲和細菌的方法為 采用貝爾曼漏斗法分離木塊中的線蟲，采用稀釋分離法分離線蟲體表的細菌。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細菌無細胞培養液制備方法為 細菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養基中，進行恒溫搖床振蕩培養，然后將細菌培養液裝入離心管內，進行高速冷凍離心機離心，取上清液用微孔濾膜的細菌過濾器過濾，得到細菌濾液。用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基檢驗是否帶菌，如帶菌，重復上述操作，直到得到細菌的無細胞培養液為止，置于冰箱中保存備用。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述無菌組培苗的培養實現方法為 選取飽滿黑松種子，溫水處理，浸泡，使種子充分吸漲，去除不飽滿種子，然后用高錳酸鉀處理，流水沖洗。剝去外種皮，無菌條件下用乙醇浸泡，升汞處理，然后用滅菌水沖洗3遍，挑于1/2瓊脂的PDA培養基上，置于恒溫培養箱，暗培養催芽，最后把無菌發芽的種子移植到MS基本培養基上，光照條件下培養I 2個月備用。
7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細菌與無菌線蟲懸浮液的制備方法為 用劃線法純化細菌，挑細菌單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基里，恒溫搖床上震蕩培養，用牛肉膏蛋白胨液體培養基稀釋菌液，調制細菌懸浮液； 用滅菌水洗下預先培養好的無菌線蟲，調整為10000條/mL線蟲懸浮液，并用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基檢驗線蟲研磨液是否帶菌。將線蟲懸浮液分別用滅過菌的離心管分裝，每管3mL，每個離心管中加入50 μ L任一細菌懸浮液，混合處理，中間不斷翻倒，使線蟲與細菌充分結合后，離心，除去上清，用滅菌水定容到3mL制成懸浮液，備用。
8.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細菌無細胞培養液毒力測定方法為 在大廣口瓶內放入3個小青霉素瓶，周圍加水少量保濕，封口膜封口滅菌。在無菌條件下往每個小青霉素瓶內加入3mL細菌無細胞培養液，以滅菌水和牛肉膏蛋白胨液體培養基為對照。然后插入無菌黑松切根苗，每個小青霉素瓶一棵無菌苗，封口膜封瓶口，平放于光照培養箱內，光照條件下培養，觀察記錄萎蔫情況和萎蔫時間。
9.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細菌與無菌線蟲混合懸浮液對松苗致病性測定方法為 在廣口瓶內放3個小青霉素瓶，每個小青霉素瓶加3ml水，封口膜封口滅菌。在無菌條件下往每個小青霉素瓶插一株切根組培苗，然后用無菌細針在無菌苗頂芽下兩片葉子處刺個傷口，并在傷口處附上一團無菌的脫脂小棉球，再往脫脂棉球上滴200 μ L細菌與線蟲混合懸浮液，并保證小棉球在24h內保持濕潤，每處理設3個重復，以單獨接種無菌線蟲、野生線蟲、滅菌水為對照，接種后將廣口瓶封口，培養箱內光照條件下培養，觀察記錄萎蔫情況，參照病害分級方法進行分級。
10.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細菌野外控制釋放和野外替代能力檢測方法為 從病區砍伐有天牛蛀洞的帶皮病死木，用紗網包裹并分成不同的處理。分別在樹皮表面噴灑美國細菌培養液；待天牛爬出洞7天后，收集紗網內的天牛，再分離天牛攜帶的松材線蟲；另外，采集松樹新鮮松枝，在針葉表面同樣噴灑美國細菌懸浮液，把林間收集的天牛放到針葉上喂食7天，收集天牛并分離天牛攜帶的線蟲；從天牛上分離的松材線蟲，灰葡萄孢培養繁殖后接種松苗，待I個月后觀察記錄松苗萎蔫情況，并分離松苗內的線蟲，再分離線蟲攜帶的細菌，根據各細菌菌落形態和后續的生化鑒定確定菌落種類，統計各目標菌株所占的比率。
全文摘要
本發明適用于線蟲病防治領域，本發明提供了一種利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法。該方法包括把美國細菌懸浮液噴灑到林間，5月份噴霧一次，連續2年，共2次噴霧；在兩三年內美國細菌替代松材線蟲體表的致病菌，以控制我國林間松材線蟲病的流行。本發明利用松材線蟲體表細菌生態位的替換，利用從美國松材線蟲體壁上分離和篩選的細菌菌株進行生物防治。該方法是把生防細菌噴灑到林間，因為該細菌具有致病力低，繁殖和替代能力強等特點，可快速替代我國松林內松材線蟲體表的強致病細菌，使松材線蟲失去致病能力，從而達到控制松材線蟲病流行的目的。該方法具有簡單易行，易于推廣應用，成本較低，效果好，作用徹底等優點。
文檔編號A01G13/00GK102630534SQ20121012081
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月24日 優先權日2012年4月24日
發明者喬雪娟, 傅軍, 劉侃誠, 孫京天, 曾腓力, 朋金和, 賁愛玲, 韓正敏 申請人:南京林業大學