專利名稱：一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法
技術領域：
本發明涉及林木育種中胚性材料的保存方法，具體涉及ー種胚性材料的超低溫冷凍保存方法。
背景技術：
在林木體細胞胚胎發生和植株再生體系中，培養材料中的胚性細胞是否能較長時間保持旺盛的分和植株再生能力也是林木體胚產業化的 重要瓶頸。目前，還沒有較好的用于保存胚性材料的方法，常用的就是低溫保藏，這種方法雖然簡單，但是保存時間短，而且細胞恢復困難，増殖能力低，根本不能長期保存。
發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法，以實現胚性材料長期保存井能使其保持高頻增殖能力。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法，包括以下步驟
(1)取待保存的胚性材料，按10%的接種量接入高滲液體培養基，25°C，培養3 10d;其中，高滲液體培養基為添加有O. Γ0. 8mg/L山梨醇的M13基本培養基；
(2)過濾步驟(I)預培養的胚性材料，裝入冷凍管，向冷凍管中加入復合玻璃化保護劑，(TC，放置脫水O 70min，然后裝入冷凍盒直接投入液氮速凍，液氮中長期保存；復合玻璃化保護劑為添加30%甘油和30%こニ醇的M13基本培養基。步驟(I)中，培養6 8d。步驟(I)中，在所述的高滲液體培養基中還加有f 5mg/L ABA和5(T200mg/L脯氨酸。步驟(2)中，所述的放置脫水，為先用60%復合玻璃化保護劑保護胚性材料過渡脫水lOmin，然后轉到100%復合玻璃化保護劑脫水l(T60min，然后再投入液氮保存。有益效果與現有技術相比，本發明的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，操作簡單，方便可行，解決了林木體胚產業化的重要瓶頸問題，可實現胚性材料長期保存到I年以上，井能使其保持高頻增殖能力，具有很好的實用性，能夠產生很好的經濟效益和社會效應。
圖I是預培養滲透劑濃度試驗結果 圖2是預培養時間試驗結果 圖3是不同溫度進行細胞復蘇結果 圖4是胚性懸浮細胞復蘇結果圖5是可溶性淀粉在恢復培養中的作用結果圖；圖中，A、B為恢復5d時的狀態，C、D為恢復25d時的狀態；
圖6是ABA對細胞存活的影響結果 圖7是山梨醇處理后內源脯氨酸的變化結果 圖8是外源脯氨酸對細胞的保護作用結果圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進ー步的說明。以下實施例的胚性材料為雜種馬褂木胚性懸浮細胞，其培養方法同中國專利申請02112948. 7 或 201010298850. 6。Μ13 基本培養基的配方為MS+2，4_D 2. 0mg/L+6，BA0. 2mg/L+LH 500mg/L + 蔗糖 30g/L, pH 值為 5. 8。實施例I
為了提高冷凍細胞的存活率，需要將胚性細胞進行預處理，采取的措施是將需要冷凍保存的胚性細胞接種在含有山梨醇等滲透調節劑滲透劑的培養基上，通過滲透調節使細胞部分脫水，減少細胞內的水分，降低冷凍過程中冰晶的形成對細胞造成的傷害。通過TTC法檢測細胞活力，從而確定合適的預處理條件。TTC法是細胞活力測定的常用方法，該方法用于檢測細胞內脫氫酶的活性。脫氫酶使氯化三苯四氮哇(TTC)還原生成ー種紅色復合物，此有色物質不溶于水，但溶于酒精。因此，用酒精抽提，然后用分光光度計測定485nm時的吸光度，吸光度高的細胞活性強，從而可以確定細胞的生理狀態。將胚性懸浮細胞繼代到高滲液體培養基中，預培養不同的天數。高滲液體培養基為在MS基本培養基中加入2. Omg/L 2，4-D、0. 2mg/L 6，BA、500mg/L LH和30g/L蔗糖，以及濃度分別為 O. Img/L、0. 2mg/L、0. 3mg/L、0. 4mg/L、0. 5mg/L、0. 6mg/L、0. 7mg/L 和 0. 8mg/L的山梨醇。結果如圖I所示，表明在不同預培養濃度下細胞存活率不同，以山梨醇濃度O. 2mol/L O. 5mol/L時進行的預培養，細胞存活率隨山梨醇濃度上升而逐漸上升，到0.6mol/L時活力達到最高。當山梨醇濃度超過O. 6mol/L吋，細胞存活率呈下降趨勢。在
O.6mol/L山梨醇濃度下冷凍細胞存活率最高的結果說明，該濃度下細胞脫水最充分，同時沒有高滲脅迫存在。通過不同預培養時間比較，結果如圖2所示，表明隨著預培養時間的増加，細胞冷凍后的活力明顯上升，在第4d和第7d處理情況下細胞活力達到ー個小高峰，隨后細胞活力開始下降，預培養時間短于3d時細胞活力明顯偏低，隨著預培養時間的延長細胞活力不斷升高并趨于穩定，說明胚性懸浮細胞對高滲環境的ー個逐步適應的過程。預培養7d吋，細胞在每個處理情況下都達到了最高值。因此，認為預培養7d是合適的時間。在進行懸浮培養中，在I :9體積比的細胞和培養基的比例下，細胞在第7d處于細胞生長的對數生長期，細胞分裂旺盛，形態結構穩定，對冷凍，化凍造成的損傷有較強的抵抗力。實施例2
將實施例I預培養的胚性懸浮細胞過濾，取適量體積(約ImL)的細胞加入冷凍管(5mL)中，向管中加入ImL復合玻璃化保護劑(含30%體積甘油、30%體積こニ醇的M13基本培養 基)，在0°C下，放置脫水O 70min，然后將冷凍管裝入冷凍盒直接投入液氮，長期保存。預培養時間對冷凍保存的成功有著極其重要的作用，通過調節滲透壓，可以提高細胞的抗逆性同時降低細胞內的含水量，從而降低冰晶產生的程度，減少對細胞的傷害。通過確定以含有O. 6mol/L山梨醇的M13號培養基為預處理培養基，細胞與培養基體積比為
I:9，以含30%こニ醇和30%甘油的M13基本培養基作為復合玻璃化保護劑，先放入60%體積(用水稀釋)的復合玻璃化保護劑過渡脫水O或lOmin，然后放入100%復合玻璃化保護劑脫水時間(TeOmin為試驗條件，對預培養時間進行篩選。結果顯示，在預培養初期，隨著培養時間的増加，細胞活力迅速上升，在培養3天時達到最高值，隨后開始下降，在第5天開始細胞活力維持在ー個相對穩定的階段，在13天時明顯下降。隨著預培養時間的増加，細胞冷凍后的活力明顯上升；在第4天和第7天，各處理細胞活力達到ー個小高峰，隨后細胞活力開始下降，預培養時間短于3天時細胞活力明顯偏低，隨著預培養時間的延長細胞活力不斷升高并趨于穩定，體現了雜交鵝掌楸胚性懸浮細胞對高滲環境的ー個逐步適應的過程。在不同的過渡脫水和脫水時間情況下，在未經過復合玻璃化保護劑處理，直接把預培養 后的細胞放入液氮中，隨著預培養時間的増加，細胞的抗性增強，呈上升趨勢，在第8天達到高值，但與經過復合玻璃化保護劑處理后的相比，其活力低于經過處理的細胞，可以發現在過渡脫水lOmin，脫水30min在各個預培養時間情況下都能活得ー個較高的細胞活力，說明處理對細胞能起到最大限度地保護作用。實施例3
將實施例2儲存胚性懸浮細胞的冷凍盒從液氮中取出，迅速將冷凍管置于不同溫度梯度水浴中，快速化凍2min。吸去冷凍保護劑，向冷凍管加入ImL的清洗培養基(即預培養基，為O. 6mol/L山梨醇的愈傷增殖培養基)，停留2min，重復3次洗滌。在本實施例設置了五個水浴溫度梯度，結果如圖4所示，發現復蘇溫度在37°C時，復蘇細胞的活力達到最高點。對于雜種馬褂木來說，該溫度條件下，細胞的活力要高于40°C的化凍溫度。通過恢復培養讓細胞迅速地從逆境條件恢復到正常培養的環境中。由于冷凍保護劑是高滲條件(O. 4M蔗糖)，如果滲透壓降低過快將導致細胞過快膨脹，從而對細胞膜產生傷害。因此緩慢地降低滲透壓可以最大限度地提高細胞存活率，該試驗步驟過程如下
第一歩高滲恢復培養把洗滌后的細胞團物質迅速轉移到墊有濾紙的高滲恢復培養基。a.培養時間梯度為l、2、3、4、5、6d，25°C培養。根據試驗結果表明，在含0.4M蔗糖
的高滲愈傷増殖培養基上培養2d較為合適。b.加入0、0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5M濃度的蔗糖調節滲透壓。根據試驗結果以蔗糖滲透壓濃度為O. 4M吋，恢復培養的細胞可以迅速達到良好狀態，在轉到愈傷增殖培養基中培養5d后就可以看到新的愈傷長出。第二歩低滲的恢復培養
a.培養天數為l、2、3、4、5、6d，含O. 3M蔗糖的低滲愈傷增殖培養基上培養2d較為合適。b.加入0、0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5M濃度的蔗糖調節滲透壓，根據試驗測定在滲透
壓濃度O. 3M時，細胞的恢復時間最短，在轉到愈傷增殖培養基中培養第5d就長出新的愈傷組織，最后轉移到愈傷增殖培養基上進行培養。復蘇后重新誘導成的體細胞胚胎，經過超低溫凍存與復蘇處理后的胚性材料，在體胚誘導培養基上培養，經過3個月的體胚發育過程，如圖4所示，能夠實現高頻體細胞胚胎發生，與沒有凍存的材料發育過程相一致。
實施例4
將實施例2凍后的胚性懸浮細胞分別接種在添加有lmg/L、2mg/L、5mg/L、I Omg/L、20mg/L可溶性淀粉的O. 4M蔗糖愈傷增殖培養基培養2天后，轉到O. 3M蔗糖的愈傷增殖培養基上培養2天，再轉到正常生長培養基上。觀察結果如圖5所示，發現接種在淀粉培養基上效果最好，細胞恢復生長的延滯較短，為2 4d，細胞生長迅速。其它兩個處理，許多細胞團要先變成黃褐色，經過9 14d的延滯后才開始生長。直接轉接在未加可溶性淀粉的培養基上，許多團塊變成白色或者褐色，不能生長。通過試驗加入不同濃度的可溶性淀粉，可以有效地消除濕潤現象，使細胞在進行滲透平衡過程時損傷最小，試驗結果表明10mg/L體細胞胚胎的發生頻率高。、
實施例5
在實施例I的預培養基中加入不同濃度的ABA，通過ABA提高細胞的抗逆性，從而提高細胞的存活率，在本試驗中，在預培養階段加入不同濃度lmg/L、2 mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L的ABA，結果如圖6所示，發現在4mg/L時能顯著地提高細胞的抗凍性，細胞存活率達到了80%。實施例6
在植物的組織、器官和全株實驗中，發現脯氨酸的積累與抗滲透脅迫之間有顯著的正相關，可以作為衡量細胞對逆境適應能力的指標。經過不同濃度的山梨醇預培養后，細胞的抗凍活力有所差異，結果如圖7所示，在超低溫保存后，O. Γ0. 6mol/L山梨醇培養后的細胞其脯氨酸含量呈直線上升；山梨醇濃度在O. 5,0. 7mol/L處的脯氨酸含量與冷凍前幾乎持平，在O. 6mol/L時脯氨酸含量超過冷凍前并達到最大值。說明超低溫條件下，盡管細胞會部分死亡，但是其體內的脯氨酸含量還是會相對的增加用來保護細胞，這也與在O. 6mol/L山梨醇預培養下超低溫保存后細胞活力最高相一致。在實施例I的預培養基中，加入脯氨酸后，細胞的存活率隨著濃度增加而提高。如圖8所示，在150mg/L時細胞存活率達到最高值，但脯氨酸含量繼續增加后，細胞存活率開始下降，說明高濃度脯氨酸可能對細胞產生了一定的毒害作用，導致細胞在外加高濃度脯氨酸情況下，細胞活力快速下降。
權利要求
1.一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取待保存的胚性材料，按10%的接種量接入高滲液體培養基，25°C，培養3 10d;其中，高滲液體培養基為添加有O. Γ0. 8mg/L山梨醇的M13基本培養基； (2)過濾步驟(I)預培養的胚性材料，裝入冷凍管，向冷凍管中加入復合玻璃化保護劑，(TC，放置脫水O 70min，然后裝入冷凍盒直接投入液氮速凍，液氮中長期保存；復合玻璃化保護劑為添加30%甘油和30%こニ醇的M13基本培養基。
2.根據權利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟(I)中，培養6 8d。
3.根據權利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟(I)中，在所述的高滲液體培養基中還加有f 5mg/L ABA和5(T200mg/L脯氨酸。
4.根據權利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟(2)中，所述的放置脫水，為先用60%復合玻璃化保護劑保護胚性材料過渡脫水lOmin，然后轉到100%復合玻璃化保護劑脫水l(T60min，然后再投入液氮保存。
全文摘要
本發明公開了一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法，包括以下步驟取待保存的胚性材料接種入高滲液體培養基，25℃培養3~10d；過濾胚性材料裝入冷凍管，加入復合玻璃化保護劑，0℃放置脫水0～70min，然后裝入冷凍盒直接投入液氮速凍，液氮中長期保存即可。本發明的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，操作簡單，方便可行，解決了林木體胚產業化的重要瓶頸問題，可實現胚性材料長期保存到1年以上，并能使其保持高頻增殖能力，具有很好的實用性，能夠產生很好的經濟效益和社會效應。
文檔編號A01N3/00GK102657152SQ20121013514
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者施季森, 陳金慧, 龍偉 申請人:南京林業大學