專利名稱：家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法的制作方法
技術領域：
本發明涉及胚胎生物技術領域，特別是涉及家畜胚胎玻璃化冷凍法。
背景技術：
隨著超數排卵技術、體外受精、胚胎移植技術以及動物克隆技術的發展，家畜胚胎已成為商品化產物。胚胎冷凍保存技術對于胚胎的商業化應用和克隆技術的推廣極為重要，家畜胚胎冷凍技術已成為胚胎工程技術中的研究熱點。近幾年胚胎的冷凍保存技術特別是玻璃化冷凍法得到了迅速的發展，玻璃化冷凍技術是快速冷凍與高濃度冷凍保護劑相結合的結果。高濃度冷凍保護劑在快速冷卻過程中形成透明的玻璃狀固體，冷卻過程中黏度很高，但無冰晶形成，避免了冷凍過程中冰晶對細胞脂質膜及細胞骨架結構的損傷，保留細胞內外液體正常的分子和離子分布。玻璃化冷凍操作步驟簡單，包括高濃度的冷凍保護劑置換細胞內外的溶液，快速降溫，使溶液黏稠度極度提高并固化，放置液氮保存。影響玻璃化冷凍效果的因素主要包括(1)冷凍保護劑。同一種組織細胞，冷凍保護劑的濃度和種類是最重要的一個影響因素。細胞外冷凍保護劑一般采用大分子物質，如多糖(蔗糖、海藻糖)聚乙二醇、胎牛血清白蛋白(BAS)和Percoll等；細胞內冷凍保護劑為具有良好穿透性的小分子物質，如二甲基亞砜、乙二醇和甘油。(2)溫度下降速度。降溫速度越快越好，可直接投入液氮的方法即微滴法，其降溫速度約為2500℃/min。(3)胚胎載體。對胚胎載體的要求是胚胎周圍的冷凍保存劑體積應盡量小，與液氮間隔盡量少，操作簡便且不易丟失胚胎。
目前的玻璃化冷凍主要采用微管法和微滴法(MICRO-DROP VITRIFICATION，MDV)。微管法中由于微管的存在，使得胚胎的冷凍速度降低，影響了冷凍保存的效率。而微滴法常規的操作是將胚胎液滴直接浸入液氮中，由于液氮中可能含有某些病原微生物，所以胚胎液滴直接與液氮接觸會造成胚胎的污染，同時胚胎液滴滴入液氮中，由于溫差的關系，胚胎液滴周圍的液氮容易氣化而形成氣團，從而影響了冷卻速度。在胚胎冷凍過程中，低溫會對胚胎的細胞骨架造成一定的損害，這在一定程度上減弱了胚胎的抗凍能力。
發明內容
針對上述領域的缺陷，本發明提供一種胚胎金屬表面玻璃化冷凍法(Metal SurfaceVitrification，MSV)，可以極大的提高胚胎冷卻速度，同時在冷凍液中加入細胞骨架保護劑——細胞松弛素B，增強了胚胎的抗凍能力，提高玻璃化冷凍效果。本發明用于家畜胚胎冷凍，可使體外受精囊胚冷凍解凍后的恢復率96％以上，孵化率80-85％。
家畜胚胎金屬表面玻璃化冷凍法，包括冷凍保護劑置換胚胎細胞內外液體和冷凍胚胎液滴的快速冷凍步驟，其特征在于快速冷凍是將冷凍胚胎液滴滴在一金屬塊的上表面，所述金屬塊浸泡或懸浮在液氮中，且其上表面露出于液氮表面。
所述金屬塊的材質優選銅塊。
所述冷凍保護劑置換胚胎細胞內外液體在39℃的恒溫臺上進行，采用如下步驟(1)將胚胎放入平衡液中平衡10-20分鐘，(2)將胚胎移入VS1液中3-5分鐘，(3)將胚胎移入VS2液中20-30秒，然后將2ul的VS2和經冷凍保護劑處理過的胚胎吸入玻璃吸管中形成冷凍胚胎液滴；所述平衡液是DPBS基礎液中加入了5μg/ml的細胞松弛素B；所述VS1液是在平衡液中加入了體積百分含量為7.5％DMSO、7.5％乙二醇；所述VS2液是在平衡液中加入了體積百分含量為16.5％DMSO、16.5％乙二醇和終濃度為0.5M蔗糖。
所述平衡液中還添加了體積百分含量為20％的血清和1％抗菌素。
所述家畜胚胎為牛體外受精囊胚或體細胞核移植囊胚。
所述冷凍胚胎的解凍方法在39℃的恒溫臺上進行，采用如下步驟(1)將冷凍胚胎放入添加了0.25M蔗糖的DPBS基礎液中1-3分鐘，(2)將胚胎移入添加了0.15M蔗糖的DPBS基礎液中5-10分鐘，(3)將胚胎移入DPBS基礎液中5-10分鐘即可。
本發明采用金屬表面玻璃化冷凍法(Metal Surface Vitrification，MSV)，將經過冷凍保護液置換后的胚胎液滴直接滴在浸入液氮的金屬表面(如圖1所示)。由于金屬浸入在液氮中，它保持有液氮溶液的低溫特點，同時又有金屬材料傳熱快的特性，當冷凍胚胎液滴直接滴在金屬表面時，它沒有穿過液氮溶液，不會形成液氮氣化時的氣團，這樣就極大的提高了冷凍速度。同時液氮中的雜質如細菌、懸浮顆粒物等不易處理干凈，易使胚胎的冷凍環境受污染，從而降低了胚胎冷凍解凍后的存活，同時也影響了胚胎的商業化應用。而金屬塊表面是很好處理干凈的。金屬塊不管是浸入液氮中或是懸浮在液氮中只要其上表面露在液氮外即可。金屬塊優選銅塊，其傳熱速度最快。
本發明中冷凍保護劑置換胚胎細胞內外液體步驟分成三步，首先在平衡液中平衡后，再加入低濃度抗凍保護劑二甲基亞砜(DMSO)和乙二醇中置換，然后在高濃度抗凍保護劑二甲基亞砜(DMSO)和乙二醇與細胞外液抗凍保護劑蔗糖中快速置換。本發明還在平衡液中添加有細胞骨架穩定劑細胞松弛素B，進一步提高胚胎的抗凍能力，同時還可添加血清及抗菌素。
冷凍胚胎液滴滴在金屬表面后快速冷卻形成玻璃化小珠，然后可以將這些小珠裝入冷凍管中液氮保存。
本發明的冷凍置換及解凍程序均在39℃的恒溫臺上完成，這一均一不變的溫度條件，使操作簡便易行。實驗證明，經本發明方法冷凍后的牛體外受精囊胚，解凍后的恢復率96％以上，孵化率80-85％；牛體細胞克隆囊胚冷凍解凍后的恢復率達94.2％，孵化率80.7％，大大提高了胚胎冷凍解凍后的成活率，為家畜胚胎的冷凍保存提供了一個新的方法和思路，從而進一步促進了家畜胚胎的商業化應用，以及家畜克隆技術在生產中的應用，提高了家畜胚胎的經濟效益。
圖1本發明家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法示意圖1-冷凍胚胎液滴，2-金屬塊，3-液氮，4-液氮容器。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
以冷凍十枚牛囊胚為例說明本發明的冷凍過程1.冷凍液的配制1.1所用各試劑藥品的生產廠家和貨號如下DPBS(Gibco，15240-013)DMSO(Sigma，D-5879)乙二醇(Sigma，E-9129)細胞松弛素B(Sigma，C-6762)抗菌素(Gibco，15240-062)蔗糖(Sigma，S-1888)血清FBS(Hyclone，SH30070.03)1.2DPBS基礎液將39.5ml DPBS，10ml FBS和0.5ml抗菌素混勻后過濾，冷藏4℃備用平衡液將10ml DPBS基礎液和50μg的細胞松弛素B混勻后過濾，冷藏4℃備用VS1將8.5ml DPBS基礎液、0.75mlDMSO、0.75ml乙二醇和50μg細胞松弛素B混勻后過濾，凍存于-20℃備用VS2將6.7ml DPBS基礎液、1.65mlDMSO、1.65ml乙二醇、1.7115g的蔗糖和50μg細胞松弛素B混勻后過濾，凍存于-20℃備用0.25M蔗糖的DPBS基礎液將0.8558g的蔗糖和10ml DPBS基礎液混勻后過濾，冷藏于4℃備用0.15M蔗糖的DPBS基礎液將0.5135g的蔗糖和10ml DPBS基礎液混勻后過濾，冷藏于4℃備用
2.冷凍過程2.1.將恒溫臺打開，并將恒溫臺溫度設定為39℃，將DPBS基礎液，平衡液，VS1，VS2，0.25M蔗糖的DPBS基礎液和0.15M蔗糖的DPBS基礎液置于培養皿中在恒溫臺上預熱；2.2.在顯微鏡下選擇形態正常的牛囊胚十枚；2.3將十枚牛囊胚在39℃的恒溫臺將胚胎放入平衡液中平衡10分鐘；2.4將胚胎移入VS1液中3分鐘；2.5將胚胎移入VS2液中20-30秒，然后將2μl的VS2和經冷凍保護劑處理過的十枚牛囊胚滴到浸在液氮表面的銅塊上，形成冷凍顆粒；2.6將含有十枚牛囊胚的冷凍顆粒保存于液氮中，直至解凍。
3.解凍過程3.1在39℃的恒溫臺，將含有十枚牛囊胚的冷凍顆粒放入添加了0.25M蔗糖的DPBS基礎液中1分鐘；3.2將十枚牛囊胚移入添加了0.15M蔗糖的DPBS基礎液中5分鐘；3.3將十枚牛囊胚移入DPBS基礎液中5分鐘；3.4觀察牛囊胚恢復情況，并進行胚胎移植。
從2006年1月至2007年1月，我們在內蒙古和北京分別進行了牛體外受精囊胚和體細胞克隆囊胚的玻璃化冷凍實驗，實驗結果如下表一牛體外受精囊胚和體細胞核移植囊胚的金屬表面玻璃化冷凍效果
圖1為本發明家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法示意圖，冷凍胚胎液滴1滴在金屬塊2上表面，該金屬塊2浸泡在液氮3中，且液氮貯存在泡沫塑料容器4中，該冷凍胚胎液滴迅速冷凍形成玻璃化小珠。
權利要求
1.家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法，包括冷凍保護劑置換胚胎細胞內外液體和冷凍胚胎液滴的快速冷凍步驟，其特征在于快速冷凍是將冷凍胚胎液滴滴在一金屬塊的上表面，所述金屬塊浸泡或懸浮在液氮中，且其上表面露出于液氮表面。
2.根據權利要求1所述的家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法，所述金屬塊的材質為銅塊。
3.根據權利要求1所述的家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法，所述冷凍保護劑置換胚胎細胞內外液體在39℃的恒溫臺上進行，采用如下步驟(1)將胚胎放入平衡液中平衡10-20分鐘，(2)將胚胎移入VS1液中3-5分鐘，(3)將胚胎移入VS2液中20-30秒，然后將2ul的VS2和經冷凍保護劑處理過的胚胎吸入玻璃吸管中形成冷凍胚胎液滴；所述平衡液是DPBS基礎液中加入了5μg/ml的細胞松弛素B；所述VS1液是在平衡液中加入了體積百分含量為7.5％DMSO、7.5％乙二醇；所述VS2液是在平衡液中加入了體積百分含量為16.5％DMSO、16.5％乙二醇和終濃度為0.5M蔗糖。
4.根據權利要求3所述的家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法，所述平衡液中還添加了體積百分含量為20％的血清和1％抗菌素。
5.根據權利要求4所述的家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法，所述家畜胚胎為牛體外受精囊胚或體細胞核移植囊胚。
6.冷凍胚胎的解凍方法，在39℃的恒溫臺上進行，采用如下步驟(1)將權利要求1-5任一方法得到的冷凍胚胎放入添加了0.25M蔗糖的DPBS基礎液中1-3分鐘，(2)將胚胎移入添加了0.15M蔗糖的DPBS基礎液中5-10分鐘，(3)將胚胎移入DPBS基礎液中5-10分鐘即可。
全文摘要
本發明涉及“家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法(Metal Surface Vitrificatiom，MSV)”，屬胚胎生物技術領域。家畜胚胎在金屬表面玻璃化冷凍法，包括冷凍保護劑置換胚胎細胞內外液體和冷凍胚胎液滴的快速冷凍步驟，其特征在于快速冷凍是將冷凍胚胎液滴滴在一金屬塊的上表面，所述金屬塊浸泡或懸浮在液氮中，且其上表面露出于液氮表面。本發明可以極大的提高胚胎的冷卻速度，避免液氮雜質污染胚胎；同時在冷凍液中加入細胞骨架保護劑——細胞松弛素B，增強了胚胎的抗凍能力，提高玻璃化冷凍效果，用于家畜胚胎冷凍，使體外受精囊胚冷凍解凍后的恢復率96％以上，孵化率80－85％。
文檔編號A01N1/02GK101066052SQ20071011900
公開日2007年11月7日 申請日期2007年6月18日 優先權日2007年6月18日
發明者張家新 申請人:北京錦繡大地農業股份有限公司