專利名稱：滇青岡與牛肝菌純共生體的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種滇青R與牛肝菌純共生關系建立的培養方法，屬于生物技術領域，具體地說是屬于植物組織培養及大型真菌菌絲體培養范疇。
背景技術：
在菌根真菌的研究中，植物與真菌的共生關系是研究的熱點及難點，很多學者曾嘗試建立一個穩定的純共生體，以在排除其他雜菌及環境干擾的前提下對真菌的侵染機制、真菌與植物的共生背景以及共生機理等進行深入的了解，但是在自然環境下符合上述條件的共生體幾乎是不存在的。
牛肝菌屬(Boletus)隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)，傘菌綱(Agaricomycetes),牛肝菌目(Boletales),牛肝菌科(Boletaceae),為世界廣布大屬。牛肝菌子實體體型較大、肉質肥厚、味道鮮美，是人類生活史中長期采食的一類美味食用真菌，另外，該屬某些種類的子實體中還含有抗氧化、抗腫瘤等功能的特殊活性物質，因而具有很高的經濟價值和研究前景。牛肝菌目前尚難以進行人工栽培，屬于一類與植物共生的菌根真菌，在自然條件下與松科、殼斗科等植物形成共生關系。牛肝菌子實體的生長發育與共生植物關系密切，對牛肝菌和其共生植物進行生物學關系的研究是探討牛肝菌子實體發生機制的可行途徑。但當研究牛肝菌與植物共生時，自然環境下根系微生物種類復雜，無法排除其它微生物對植物根系的干擾作用，這局限了一批現代技術在牛肝菌與植物共生機制研究上的運用。漠青同{Cyclobalanopsisglaucoides )為殼斗科(Fagaceae)，青網屬(Cyclobalanopsis Oerst.)植物，其種子大、發芽率高；美味牛肝菌(B. edulis s. I.)為著名的可食用真菌，在牛肝菌屬中具有典型代表性，且在云南分布廣泛。因此本發明分別以武定獅子山采集的滇青R種子及一株廣義美味牛肝菌子實體為材料，誘導了愈傷組織及菌絲體，并對二者進行了共培養，在無菌狀態下建立了一個愈傷組織與菌絲體的穩定純共生體系。為今后利用基因敲除或其他技術研究牛肝菌與滇青網植物的共生關系、共生機理、牛肝菌子實體發生的分子機制等奠定了重要基礎。
發明內容
本發明的目的在于，在無菌條件下建立一種簡單穩定的牛肝菌與滇青網植物的共生體系。實現本發明的技術方案利用殼斗科滇青網植物種子，成功得到了無菌苗及愈傷組織，利用美味牛肝菌子實體誘導了菌絲體，將愈傷組織與菌絲體進行共培養，室內建立了共培養體系，實現本發明的主要步驟如下
(I)滇青R愈傷組織的誘導及培養于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 s，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于O. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min,取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進種子萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 00 I. 50mg/L，NAA O. 08 O. 10mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養9 12天后開始萌發，轉入2000 2500Lux的光照下培養20 23天，長成8 IOcm的高莖桿小苗(葉少莖長);將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 Cm長的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導培養基(MS培養基，蔗糖 30. 00 g/L，6-BA O. 80 I. 00mg/L, IAA2. 00 2. 50 mg/L，瓊脂 7. 50g/L, pH 為5. 40 5. 60)中，每瓶接種I 2個莖段，21 22°C下暗培養10 13天后，與培養基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，30 35天愈傷組織直徑達2. O 3. O cm；將已長成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養基(MS培養基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA O. 80 I. 00 mg/L, NAA I. 50 2. 00mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 5. 40 5. 60)中，19 23天，形成疏松的團塊狀組織，48 51天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；
(2)美味牛肝菌菌絲體的誘導及培養于獅子山采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球， 輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 30 0. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /UKH2PO4O. 50g/L、NH4NO3 0.40g/L、KN03 0 . 40g /L、VB1 0. 10mg/L、麥芽汁 150ml/L、谷氨酸0. 16g/L、瓊脂13. 00g/L,pH5. 40)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養7天，菌塊周圍開始萌發出白色菌絲，60天菌絲體基本長滿培養基；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(淀粉5.00g/L，葡萄糖2. 50g/L，蛋白胨4. 13g/L，MgSO4L 00g /L,CaCl2 I. 00g /LjKH2PO4 0. 50g /L,VB1 0.10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. 00g/L，ρΗ5· 40)進行擴大培養；
(3)滇青R愈傷組織與牛肝菌菌絲體的共培養將上面已繼代生長30 35天的滇青岡愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進共培養培養基(1/2MS 培養基，蔗糖 10. 00 13. 00 g/L,淀粉 2. 00 3. 00g/L,葡萄糖 I. 00 2. 00g/L,蛋白胨 2. 00 3. 00g/L，VB1 0.05 0. 10mg/L，谷氨酸 0. 08 0. 12g/L，6-BA0. 80 I. 00mg/L, NAA1. 70 2. 50 mg/L，瓊脂 8. 00 10. 00 g/L, pH 5· 4 5· 6)中，每瓶接一個，將培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進行4個方向的等距離接種，30 35天建立起一個無菌穩定的共生體系。本發明的有益效果是創新性地建立了滇青網與牛肝菌的無菌共培養體系，其特點如下，
(O以滇青R為例，摸索出了一套共生植物的愈傷組織誘導方法，該方法簡單、快速、成功率聞;
(2)提供了一種同時適合愈傷組織和菌絲體生長的共培養基，該培養基配制簡單，易操
作；
(3)提供了一種植物與真菌共生關系建立的方法，為其它大型真菌與共生植物的研究提供了方法借鑒。
具體實施方式
以下的實施例子是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實例一
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種； 將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0.1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進種子萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 50mg/L, NAAO. 10mg/L，瓊脂7.50 g/L，pH為6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養10天后開始萌發，轉入2000 2500LUX的光照下培養20天，長成IOcm的高莖桿小苗(葉少莖長);將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 cm長的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導培養基(MS 培養基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA I. 00mg/L, IAA2. 00mg/L，瓊脂 7. 50g/L, pH為5. 60)中，每瓶接種I 2個莖段，21 22°C下暗培養10天后，與培養基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，30天愈傷組織直徑達3. O cm ;將已長成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養基(MS培養基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA I. 00 mg/L,NAA I. 50mg/L,瓊脂7. 50 g/L, pH為5. 60)中，20天，形成疏松的團塊狀組織，50天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；
于獅子山采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 30 0. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO30. 40g/L、KNO3O. 40g /L、VB10. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 16g/L、瓊脂 13. OOg/L,pH5. 40)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養7天，菌塊周圍開始萌發出白色菌絲，60天菌絲體基本長滿培養基；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(淀粉5. 00g/L,葡萄糖 2. 50g/L，蛋白胨 4. 13g/L，MgSO4L 00g /L, CaCl2 I. 00g /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi0. 10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. 00g/L, pH5. 40)進行擴大培養；
將上面已繼代生長30天的滇青R愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進共培養培養基(1/2MS培養基，蔗糖10. 00g/L,淀粉2. 50g/L,葡萄糖 I. 25g/L，蛋白胨 2. 06g/L,VB10. 05mg/L，谷氨酸 0. 08g/L，6_BAl. 00mg/L，NAAl. 70mg/L，瓊月旨10.00 g/L, pH 5.6)中，每瓶接一個，將培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進行4個方向的等距離接種，35天建立起一個無菌穩定的共生體系。實例二
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0.1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進種子萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 30mg/L, NAA
0.10mg/L，瓊脂7.50 g/L，pH為6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養11天后開始萌發，轉入2000 2500LUX的光照下培養22天，長成IOcm的高莖桿小苗(葉少莖長);將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 cm長的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導培養基(MS 培養基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA O. 80mg/L, IAA2. 20mg/L，瓊脂 7. 50g/L, pH為5. 40)中，每瓶接種I 2個莖段，21 22°C下暗培養12天后，與培養基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，32天愈傷組織直徑達2. 5cm ;將已長成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養基(MS培養基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA O. 80mg/L, NAA
1.80mg/L,瓊脂7. 50 g/L, pH為5. 40)中，19天，形成疏松的團塊狀組織，48天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；
于獅子山采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約O. 30 O. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬 鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO30. 40g/L、KNO3O. 40g /L、VB10. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 16g/L、瓊脂 13. OOg/L,pH5. 40)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養7天，菌塊周圍開始萌發出白色菌絲，60天菌絲體基本長滿培養基；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(淀粉5. 00g/L,葡萄糖 2. 50g/L，蛋白胨 4. 13g/L，MgSO4L 00g /L, CaCl2 I. 00g /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi0. 10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. 00g/L, pH5. 40)進行擴大培養；
將上面已繼代生長35天的滇青R愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進共培養培養基(1/2MS培養基，蔗糖12.00 g/L，淀粉2. 00g/L，葡萄糖 I. 00g/L，蛋白胨 2. 00g/L, VB10. 10mg/L，谷氨酸 0. 10g/L，6_BA0. 80mg/L, NAA2. 00 mg/L,瓊脂8.00g/L，pH 5.6)中，每瓶接一個，將培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進行4個方向的等距離接種，32天建立起一個無菌穩定的共生體系。實例三
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0.1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進種子萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 00mg/L, NAA
0.08mg/L，瓊脂7.50 g/L，pH為6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養9天后開始萌發，轉入2000 2500LUX的光照下培養23天，長成8cm的高莖桿小苗(葉少莖長);將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 cm長的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導培養基(MS培養基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 0. 90mg/L, IM2. 30 mg/L，瓊脂 7. 50g/L，pH為5. 60)中，每瓶接種I 2個莖段，21 22°C下暗培養13天后，與培養基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，35天愈傷組織直徑達3.0 cm ；將已長成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養基(MS培養基，蔗糖30. 00 g/L, 6-BA 0. 90mg/L, NAA
2.00mg/L,瓊脂7. 50 g/L, pH為5. 60)中，23天，形成疏松的團塊狀組織，51天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；于獅子山采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約O. 30 O. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO30. 40g/L、KNO3O. 40g /L、VB10. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 16g/L、瓊脂 13. OOg/L,pH5. 40)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養7天，菌塊周圍開始萌發出白色菌絲，60天菌絲體基本長滿培養基；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(淀粉5. 00g/L,葡萄糖 2.50g/L，蛋白胨 4. 13g/L，MgSO4L 00g /L, CaCl2 l.OOg /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi0. 10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. 00g/L, pH5. 40)進行擴大培養；
將上面已繼代生長32天的滇青R愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進共培養培養基(1/2MS培養基，蔗糖13.00 g/L，淀粉2. 00g/L，葡萄糖 I. 00g/L，蛋白胨 3. 00g/L, Vbi 0. 08mg/L，谷氨酸 0. 12g/L，6_BA0. 90mg/L，NAA2. 30 mg/L,瓊脂9.00g/L，pH 5.4)中，每瓶接一個，將培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器 截取，將截取的4個菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進行4個方向的等距離接種，30天建立起一個無菌穩定的共生體系。實例四
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0.1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進種子萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 20mg/L, NAA
0.08mg/L，瓊脂7.50 g/L，pH為6. 80)，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養12天后開始萌發，轉入2000 2500LUX的光照下培養21天，長成9cm的高莖桿小苗(葉少莖長);將小苗的莖截下，裁剪成I. O I. 5 cm長的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導培養基(MS 培養基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA I. 00mg/L, IAA2. 50mg/L，瓊脂 7. 50g/L, pH為5. 40)中，每瓶接種I 2個莖段，21 22°C下暗培養13天后，與培養基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，33天愈傷組織直徑達2. 7cm ;將已長成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養基(MS培養基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA 1.00 mg/L, NAA
1.60mg/L,瓊脂7. 50 g/L, pH為5. 40)中，21天，形成疏松的團塊狀組織，49天愈傷組織逐漸老化，色澤加深；
于獅子山采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 30 0. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO30. 40g/L、KNO3O. 40g /L、VB10. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0. 16g/L、瓊脂 13. OOg/L,pH5. 40)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養7天，菌塊周圍開始萌發出白色菌絲，60天菌絲體基本長滿培養基；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(淀粉5. 00g/L,葡萄糖 2.50g/L，蛋白胨 4. 13g/L，MgSO4L OOg /L, CaCl2 l.OOg /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi0. 10mg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. OOg/L, pH5. 40)進行擴大培養；
將上面已繼代生長33天的滇青R愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進共培養培養基(1/2MS培養基，蔗糖11. 00g/L,淀粉3. 00g/L,葡萄糖 2. 00g/L，蛋白胨 2. 50g/L,VB1 0.05mg/L，谷氨酸 0. 08g/L，6-BA1. 00 mg/L,NAA2. 50 mg/L，瓊脂10.00 g/L, pH 5.4)中，每瓶接一個，將培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進行4個方向的等距離接種，34天建 立起一個無菌穩定的共生體系。
權利要求
1.一種滇青岡與牛肝菌純共生關系的建立方法，其特征為，利用野外采集的滇青岡(Cyclobalanopsis glaucoides )種子培養無菌苗,誘導愈傷組織,利用野外采集的美味牛肝菌(Boletus edulis s. I.)子實體誘導菌絲體,將愈傷組織與菌絲體進行共培養,室內建立共生關系，主要包括下列步驟 (1)滇青R愈傷組織的誘導及培養于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗2次；將種子放置于0. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min,取出種子，用無菌水清洗2 3次；將消毒處理后的種子芽胚朝上接進萌發培養基，每瓶接種I 2顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養9 12天后開始萌發，轉入2000 2500Lux的光照下培養20 23天，長成8 IOcm的高莖桿小苗(葉少莖長)；將小苗的莖截下，裁剪成I. 0 I. 5 cm長的小莖段，將其接種至愈傷組織誘導培養基中，每瓶接種I 2個莖段，21 22°C下暗培養10 13天后，與培養基接觸的莖段基部開始膨大，并逐漸分化出愈傷組織，30 35天愈傷組織直徑達2. 0 3. 0 cm ;將已長成的愈傷組織均勻切分成6 8小塊，接種至繼代培養基中，19 23天，形成疏松的團塊狀組織，48 51天愈傷組織逐漸老化，色澤加深； (2)美味牛肝菌菌絲體的誘導及培養于獅子山采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的美味牛肝菌子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 30 0. 50cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基表面，培養溫度為22 23°C，暗培養7天，菌塊周圍開始萌發出白色菌絲，60天菌絲體基本長滿培養基；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基進行擴大培養； (3)滇青R愈傷組織與牛肝菌菌絲體的共培養將上面已繼代生長30 35天的滇青岡愈傷組織取出，切分成大小相近的8 10塊，分別將切好的愈傷組織接種進共培養培養基中，每瓶接一個，將培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的4個菌絲塊圍繞已接種的愈傷組織進行4個方向的等距離接種，30 35天建立起一個無菌穩定的共生體系。
2.根據權利要求I所述的滇青網與牛肝菌共生關系的建立方法，其特征在于步驟(I)中的 滇青岡種子萌發培養基為MS培養基，無糖，6-BA I. 00 I. 50mg/L，NAA 0. 08 0.10mg/L，瓊脂7. 50 g/L，pH為6. 80 ;愈傷組織誘導培養基為=MS培養基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA 0. 80 I. 00mg/L, IAA2. 00 2. 50 mg/L,瓊脂 7. 50g/L, pH 為 5. 40 5. 60 ;愈傷組織繼代培養基為=MS培養基，蔗糖30. 00 g/L，6-BA 0. 80 I. 00 mg/L, NAA I. 50 2.00mg/L,瓊脂 7. 50 g/L, pH 為 5. 40 5. 60。
3.根據權利要求I所述的滇青網與牛肝菌共生關系的建立方法，其特征在于步驟(2)中的 美味牛肝菌菌絲體的誘導培養基為馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、MgS04l. OOg/L、CaCl2L 00g /L、KH2PO4O. 50g/L、NH4NO3 0. 40g/L、KNO3 0. 40g /L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁150ml/L、谷氨酸0. 16g/L、瓊脂13. OOg/L, pH5. 40 ;擴大培養基為淀粉5. 00g/L，葡萄糖·2.50g/L，蛋白胨 4. 13g/L, MgSO4L OOg /L, CaCl2 I. OOg /L, KH2PO4 0. 50g /L, Vbi 0. IOmg/L，谷氨酸 0. 16g/L，瓊脂 10. OOg/L, pH5. 40。
4.根據權利要求I所述的滇青網與牛肝菌共生關系的建立方法，其特征在于步驟(3)中的共培養培養基為1/2MS培養基，蔗糖10. 00 13. 00 g/L，淀粉2. 00 3. 00g/L，葡萄糖 I. 00 2. 00g/L，蛋白胨 2. 00 3. 00g/L，Vbi 0. 05 0. 10mg/L，谷氨酸 0.08 0.12g/L，6-BA0. 80 I. 00 mg/L, NAA1. 70 2. 50 mg/L，瓊脂 8. 00 10. 00 g/L, pH 5. 4 5. 6。
全文摘要
本發明涉及一種滇青岡與牛肝菌純共生關系的建立方法，屬于生物技術領域(植物組織與真菌培養)。在菌根真菌的研究中，尚難以建立一個穩定的植物與真菌的純共生體。牛肝菌目前尚難以人工栽培，屬于一類與植物共生的菌根真菌，在自然條件下與松科、殼斗科等植物形成共生關系。本發明以武定獅子山采集的滇青岡種子及一株廣義美味牛肝菌子實體為材料，成功地分別誘導了愈傷組織、菌絲體，并對愈傷組織與菌絲體進行了創新性共培養，在無菌狀態下建立了一個簡單穩定的純共生體系。這為今后進一步研究牛肝菌與滇青岡等植物的共生關系、共生機理、牛肝菌子實體發生的分子機制等奠定了重要基礎，也為其它大型真菌與共生植物的研究提供了方法借鑒。
文檔編號A01G1/04GK102754596SQ201210205939
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者吳鵬, 周文, 張曦予, 李宗菊, 李彪, 王鵬飛 申請人:云南大學