一種促進冬蟲夏草菌產分生孢子的方法
【專利摘要】本發明公開了一種促進冬蟲夏草菌產分生孢子的方法。該促進冬蟲夏草菌產分生孢子的方法，包括將冬蟲夏草菌在營養刺激和環境刺激的條件下進行培養的步驟；所述步驟包括：1）將冬蟲夏草菌在富營養固體培養基上在黑暗條件下培養，得到菌絲體；2）將所述步驟1）的菌絲體轉移到次營養固體培養基上進行下述至少一種刺激培養，得到分生孢子：冷激培養、熱激培養、溫度周期刺激培養、光周期刺激培養、溫度光周期刺激培養和氧化刺激培養；所述富營養固體培養基的氮源含量高于所述次營養固體培養基，所述冬蟲夏草菌在富營養固體培養基中的菌落生長速率大于所述冬蟲夏草菌在次營養固體培養基中的菌落生長速率。
【專利說明】一種促進冬蟲夏草菌產分生孢子的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種促進冬蟲夏草菌產分生孢子的方法。
【背景技術】
[0002]冬蟲夏草菌[Ophiocordycepssinensis (Berk.) G.H.Sung, J.M.Sung, Hywel-Jones&Spatafora ( = Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)]是青藏高原特有的名貴藥用菌，現代研究表明冬蟲夏草具有多種藥理作用，具有很好的應用前景。盡管已經對冬蟲夏草做了大量研究工作，但迄今在人工栽培方面還存在明顯的技術難題。解決這些問題需要更全面地掌握冬蟲夏草菌的生物學性狀。因此，冬蟲夏草菌生物學研究技術的創新，具有重要的理論和實踐意義。
[0003]在冬蟲夏草菌培養研究中，分生孢子的研究與菌劑的制備密切相關。目前，冬蟲夏草菌分生孢子研究中的主要困難是分生孢子產量少、周期長，使人工培養獲得分生孢子，以及分生孢子懸液的制備一直沒有很好地得到解決。如何通過培養獲得大量分生孢子，已逐漸成為冬蟲夏草菌生物學研究的瓶頸。
【發明內容】
[0004]本發明的一個目的是提供一種促進冬蟲夏草菌產生分生孢子的方法。
[0005]本發明所提供的促進冬蟲夏草菌產生分生孢子的方法，包括將冬蟲夏草菌在營養刺激和環境刺激的條件下進行培養的步驟；所述步驟包括:
[0006]I)將冬蟲夏草菌在`富營養固體培養基上在黑暗條件下培養，得到菌絲體；
[0007]2)將所述步驟I)的菌絲體轉移到次營養固體培養基上進行下述至少一種刺激培養，得到分生孢子:冷激培養、熱激培養、溫度周期刺激培養、光周期刺激培養、溫度光周期刺激培養和氧化刺激培養；所述富營養固體培養基的氮源含量高于所述次營養固體培養基，所述冬蟲夏草菌在富營養固體培養基中的菌落生長速率大于所述冬蟲夏草菌在次營養固體培養基中的菌落生長速率；
[0008]所述冷激培養是將所述菌絲體先置于所述菌絲體能夠存活但不利于生長的低溫中黑暗培養再置于適宜所述菌絲體生長的溫度中黑暗培養至產生分生孢子；
[0009]所述熱激培養是將所述菌絲體先置于所述菌絲體能夠存活但不利于生長的高溫中黑暗培養再置于所述適宜所述菌絲體生長的溫度中黑暗培養至產生分生孢子；
[0010]所述溫度周期刺激培養是將所述菌絲體置于所述適宜所述菌絲體生長的溫度和所述高溫交替的環境中黑暗培養至產生分生孢子，或將所述菌絲體置于所述適宜所述菌絲體生長的溫度和所述低溫交替的環境中黑暗培養至產生分生孢子；
[0011]所述光周期刺激培養是將所述菌絲體置于所述適宜所述菌絲體生長的溫度在每天既有光照又有黑暗的條件下培養至產生分生孢子；
[0012]所述溫度光周期刺激培養是將所述菌絲體置于所述適宜所述菌絲體生長的溫度和所述高溫交替的環境中在每天既有光照又有黑暗的條件下培養至產生分生孢子，或將所述菌絲體置于所述適宜所述菌絲體生長的溫度和低溫交替的環境中在每天既有光照又有黑暗的條件下培養至產生分生孢子；
[0013]所述氧化刺激培養是將所述菌絲體先置于具有氧化脅迫的環境中培養再置于所述適宜所述菌絲體生長的溫度中黑暗培養至產生分生孢子。
[0014]本發明中，所述營養刺激是指將菌絲體在所述富營養固體培養基進行菌絲體培養，在所述次營養固體培養基中進行產孢培養。
[0015]所述冬蟲夏草菌的適宜生長溫度可為10 - 23°C，如15 - 18°C ；
[0016]所述低溫是低于所述菌絲體生長的適宜溫度且所述菌絲體能夠存活但不利于生長的溫度，如-40-4°C ;所述高溫是高于所述菌絲體生長的適宜溫度且所述菌絲體能夠存活但不利于生長的溫度，如24 - 30°C。所述低溫具體可為-20-4°C，所述高溫具體可為28 - 30。。。
[0017]上述方法中，所述冷激培養可為將所述菌絲體先置于所述低溫中黑暗培養I天再置于所述適宜所述菌絲體生長的溫度中黑暗培養至產生分生孢子；
[0018]所述熱激培養可為將所述菌絲體先置于所述高溫中黑暗培養I小時再置于適宜所述菌絲體生長的溫度中黑暗培養至產生分生孢子；
[0019]所述溫度周期刺激培養中，所述適宜所述菌絲體生長的溫度和所述高溫交替是第奇數天的溫度為所述適宜所述菌絲體生長的溫度，第偶數天的溫度為所述高溫；或是第偶數天的溫度為所述適宜所述菌絲體生長的溫度，第奇數天的溫度為所述高溫；
[0020]所述溫度周期刺激培養中，所述適宜所述菌絲體生長的溫度和所述低溫交替是第奇數天的溫度為所述適宜所述菌絲體生長的溫度，第偶數天的溫度為所述低溫；或是第偶數天的溫度為所述適宜所述 菌絲體生長的溫度，第奇數天的溫度為所述低溫；
[0021]所述溫度光周期刺激培養中，所述適宜所述菌絲體生長的溫度和所述高溫交替是每天光照條件下的溫度為所述適宜所述菌絲體生長的溫度，每天黑暗條件下的溫度為所述高溫；
[0022]所述溫度光周期刺激培養中，所述適宜所述菌絲體生長的溫度和所述低溫交替是每天光照條件下的溫度為所述適宜所述菌絲體生長的溫度，每天黑暗條件下的溫度為所述低溫；
[0023]所述光周期刺激培養和所述溫度光周期刺激培養中，所述每天既有光照又有黑暗的條件可為每天16小時光照8小時黑暗；
[0024]所述氧化刺激培養可為將所述菌絲體先置于20 - 25mM雙氧水中黑暗培養5分鐘再置于所述適宜所述菌絲體生長的溫度中黑暗培養至產生分生孢子。
[0025]上述方法中，所述步驟I)中的培養溫度為所述適宜所述菌絲體生長的溫度。
[0026]上述方法中，所述光照的強度可為48001UX。
[0027]上述方法中，所述冷激培養、熱激培養和氧化刺激培養中，所述再置于適宜所述菌絲體生長的溫度中黑暗培養至產生分生孢子的時間具體可為14天。所述溫度周期刺激培養、所述光周期刺激培養和所述溫度光周期刺激培養的培養時間均為14天。
[0028]上述方法中，I升所述富營養固體培養基具體可由如下物質制成:復合氮源
10.0 - 50.0克，土豆200.0克，單糖或雙糖20.0克，酵母提取物1.0 - 2.0克，蛋白胨1.0 -5.0克，蠶蛹粉10.0 - 25.0克，瓊脂和水；所述復合氮源為麥麩、奶粉、豆柏或玉米粉；所述單糖或雙糖為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或乳糖。其中，所述瓊脂的質量只要達到形成固體培養基的量即可，所述水用于將培養基體積定容至I升。
[0029]I升所述次營養固體培養基具體可由如下物質制成:土豆200.0克，單糖或雙糖
20.0克，瓊脂和水；所述單糖或雙糖為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或乳糖。其中，所述瓊脂的質量只要達到形成固體培養基的量即可，所述水用于將培養基體積定容至I升。
[0030]本發明還提供了只通過營養刺激促進冬蟲夏草菌產分生孢子的方法。
[0031]該促進冬蟲夏草菌產分生孢子的方法，包括如下步驟:
[0032]I)將冬蟲夏草菌在富營養固體培養基上在黑暗條件下培養，得到菌絲體；
[0033]2)將所述步驟I)的菌絲體轉移到次營養固體培養基上黑暗培養至產生分生孢子;
[0034]所述富營養固體培養基的營養元素含量高于所述次營養固體培養基，所述冬蟲夏草菌在富營養固體培養基中的菌落生長速率是所述冬蟲夏草菌在次營養固體培養基中的菌落生長速率的1.14-1.89倍。
[0035]所述步驟I)和步驟2)中的培養溫度均可為上述適宜所述菌絲體生長的溫度，如10-23。。或 15-18。。。
[0036]上述所有方法中，所述冬蟲夏草菌具體可為冬蟲夏草菌1621和冬蟲夏草762 ;所述冬蟲夏草菌1621在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.6445 ;所述冬蟲夏草762在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.279·3。所述菌落生長速率具體可為所述冬蟲夏草菌在15°C黑暗培養70天內的菌落生長速率。所述冬蟲夏草菌在富營養固體培養基中的菌落生長速率可為所述冬蟲夏草菌在次營養固體培養基中的菌落生長速率的1.14-1.89倍，如1.66-1.84倍、1.66倍或1.84倍。
[0037]冬蟲夏草菌(Ophiocordyceps sinensis) 1621已于2012年9月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
[0038]上述所有方法中，為了便于所述冬蟲夏草菌的轉移以及收集分生孢子，所述富營養固體培養基和所述次營養固體培養基表面上均可鋪有能截留所述冬蟲夏草菌的分生孢子的半透膜，所述冬蟲夏草菌接種到所述半透膜上，所述半透膜能透過培養基中組分但能截留所述冬蟲夏草菌的分生孢子。
[0039]本發明的方法通過營養刺激培養冬蟲夏草菌，或者通過營養刺激和環境刺激的雙重刺激培養來促進冬蟲夏草菌產生分生孢子。本發明的實驗證明，采用本發明提供的方法制備分生孢子，其1621產率為每45 - 50mg (干重)菌種得到不低于2.78X IO6個分生孢子。本發明的產孢方法操作簡單、省時省力，對設備、試劑的要求很低，一般的實驗室條件即可滿足要求；另一方面，冬蟲夏草菌分生孢子與冬蟲夏草菌對蝠蛾幼蟲的侵染有密切關系，獲得大量分生孢子將促進冬蟲夏草菌生理學、冬蟲夏草菌菌劑制備和冬蟲夏草半人工培植的研究。
[0040]保藏說明
[0041]菌種名稱:冬蟲夏草菌
[0042]拉丁名:0phiocordycepssinensis
[0043]菌株編號:1621[0044]保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0045]保藏機構簡稱:CGMCC
[0046]地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號
[0047]保藏日期:2012年9月4日
[0048]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.6445
【具體實施方式】
[0049]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0050]下述實施例中用于制備固體培養基平板的培養皿均相同，直徑為9.0cm0[0051 ] 下述實施例中的培養基如下:
[0052]每IL富營養固體培養基由如下物質制成:50.0g麥麩、200.0g 土豆、20.0g葡萄糖、5.0g魚蛋白胨、1.0g酵母提取物、25.0g蠶蛹粉、20.0g瓊脂和水。其中，用水將培養基定容至1000mL。
[0053]每IL次營養固體培養基由如下物質制成:200.0g 土豆,20.0g葡萄糖,20.0g瓊脂和水。其中，用水將培養基定容至1000mL。
[0054]每IL水瓊脂固體培養基由如下物質制成:20.0g瓊脂和水。其中，用水將培養基定容至lOOOmL，121°C濕熱滅菌半小時得到培養基。
[0055]每IL液體菌種培養基由如下物質制成:50.0g麥麩,200.0g 土豆,20.0g葡萄糖，
5.0g魚蛋白胨,1.0g酵母提取物,用水`定容至1000mL。
[0056]每IL固體菌種培養基由如下物質制成:50.0g麥麩,200.0g 土豆,20.0g葡萄糖，
5.0g魚蛋白胨，1.0g酵母提取物，20.0g瓊脂，用水定容至1000mL。
[0057]上述培養基pH自然即可。
[0058]上述富營養固體培養基的配制方法如下:將麥麩、蠶蛹粉煮沸10分鐘，加入切成小塊的去皮土豆再煮沸半小時，然后用紗布過濾，在濾液中，按上述配方加入其他成分，用水定容至lOOOmL，121°C濕熱滅菌半小時得到培養基。
[0059]次營養培養基的配制方法如下:將切成小塊的去皮土豆煮沸20分鐘，然后用紗布過濾，在濾液中，按上述配方加入其他成分，用水定容至lOOOmL，121°C濕熱滅菌半小時得到
培養基。
[0060]液體菌種培養基和固體菌種培養基的配制方法如下:將麥麩煮沸10分鐘，加入切成小塊的去皮土豆再煮沸半小時，然后用紗布過濾，在濾液中，按上述配方加入其他成分，用水定容至lOOOmL，121°C濕熱滅菌半小時得到培養基。
[0061 ] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0062]下述實施例中的冬蟲夏草菌種液按照如下方法制備:將冬蟲夏草菌接種于上述固體菌種培養基，15°C黑暗培養90天，獲得冬蟲夏草菌菌種。用無菌水洗冬蟲夏草菌菌種平板，將洗下來的菌懸液按體積比20%的接種量接種于上述液體菌種培養基中，裝瓶量為三角瓶容積的1/5，然后在18°C，轉速100rpm，24小時黑暗條件下進行振蕩培養14天，得到冬蟲夏草菌第一菌種液；按體積比10%的接種量，將冬蟲夏草第一菌種液接種于新的液體菌種培養基中，其它培養條件同，得到冬蟲夏草菌第二菌種液。
[0063]下述實施例中分生孢子的洗脫方法如下:將玻璃紙上的菌絲體轉移至含有10個玻璃珠的三角瓶中，加入0.1%吐溫80溶液，轉速200rpm，劇烈振蕩I小時洗脫分生孢子，重復洗脫三次，合并洗脫液。將洗脫液依次通過150目、300目和500目細胞篩，得到除去菌絲段的洗脫液，1000Orpm離心10分鐘，獲得分生孢子沉淀，用0.1%吐溫80重新懸浮分生孢子，血球計數板計數。
[0064]下述實施例中血球計數板計數法如下:將分生孢子懸液置于血球計數板上，顯微鏡下觀察，在400倍放大倍數下計數，統計分生孢子數量，取平均值。
[0065]為了更好地理解本發明，下面以冬蟲夏草菌1621和冬蟲夏草762為例闡釋本發明，這些實施例用于理解而不是限制本發明。
[0066]其中，冬蟲夏草菌1621是姚一建研究組于2008年8月從中國青海省果洛州瑪沁縣大武鄉采集得到，已于2012年9月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為 CGMCC N0.6445。
[0067]冬蟲夏草菌1621的生物學特性如下:
[0068]1、形態學特性:在固體菌種培養基上，菌落呈雪白色，菌落表面不凸起，有一層細白致密絨毛狀菌絲體，有皺褶或沒有皺褶。邊緣有散射狀絨毛菌絲，培養基背面呈明顯的棕褐色。顯微觀察其菌絲體無色，有隔膜，分枝，寬2.2 - 5.4 μ m(大多數菌絲寬2.2 - 4.3 μ m)。分生孢子梗為瓶形，無色，單生或2-8個簇生，但不形成孢梗束。分生孢子無色，無隔膜，腎形或長橢圓形，5.4- 14.0X3.2 - 5.4μπι (多數為 5.4 - 14.0 X 3.2 - 4.3 μ m)，單生或 2 - 6個一群(多數為2 - 4個一群)，為一檸檬形粘膜所包圍。處于生長衰亡期的菌絲及分生孢子逐漸變為深褐色或黑色。
[0069]2、分子生物學特性:按照文獻[Jiang，Y.&Yao，Y.-J.(2006) ITSsequence analysis and ascomatal development of Pseudogymnoascus roseus.Mycotaxon.94:55 - 73.]的方法，菌株培養物經DNA提取、PCR擴增核糖體DNA內轉錄間隔區(ITS)并測序，其ITS序列如序列表中的序列I所示，該序列與冬蟲夏草762的序列一致。
[0070]冬蟲夏草762已于2008年12月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.2793，該菌株已公布在中國專利
【發明者】姚一建, 任蜀豫 申請人:中國科學院微生物研究所