專利名稱：小麥籽粒脂肪氧化酶基因的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種與小麥脂肪氧化酶活性相關的分子標記及其應用。
背景技術：
小麥是我國的主要儲糧作物之一，良好的儲糧品質對糧食安全具有重要意義。在一般的儲藏條件下，小麥從第二年開始逐漸陳化變質，南方高溫高濕地區尤為明顯。影響小麥儲藏品質的因素較多，包括收獲季節的氣候條件、晾曬、運輸、倉儲等外在環境條件和脂肪氧化酶活性等內在因素，且脂肪氧化酶活性高低是直接影響小麥耐儲藏性的主要內在原因。因此，開發LOX基因的分子標記，利用分子育種手段，培育耐存儲的小麥品種，是解決糧食安全的重要途徑之一。
1932年，Andre和Hou首次提出脂肪氧化酶(L0X或Lpx, lipoxygenase)的存在， 在那以后LOX的研究取得快速的發展。研究者們先后在大豆、擬南芥、水稻、向日葵、黃瓜、 亞麻、大麥和小麥等作物植株和籽粒中發現了 L0X。目前，已有的研究表明，LOX活性低，有利于增強小麥等作物的耐儲藏性。LOX基因在大麥中的研究較多，大麥LOX基因DNA序列已經發表(GenBank編號HVU83904)。在普通小麥中，對LOX的研究較少，王慧等研究發現，LOX 活性在基因型間和環境間的差異皆達到極顯著水平，且基因型對小麥LOX活性的效應大于環境及基因型與環境互作效應，認為基因型是影響小麥LOX活性的主要因素，但環境因素亦不可忽視。Hongwei Geng等在研究普通小麥的TaLox-Bl時發現，TaLox-Bl位點存在兩個具有SNP的等位基因TaLox-Bla和TaLox-Blb，LOX活性較高的小麥品種含有TaLox-Bla， LOX活性較低的小麥品種含有TaLox-Blb。發明內容
本發明的一個目的是提供一種與小麥脂肪氧化酶活性相關的分子標記及其應用。
本發明所提供的與小麥脂肪氧化酶活性相關的分子標記，具體為序列表中序列4 所不的DNA分子(分子標記B)。
本發明所提供的與小麥脂肪氧化酶活性相關的分子標記，具體也可由分子標記A、 分子標記B和分子標記C組成；所述分子標記A為序列表中序列3所示的DNA分子；所述分子標記B為序列表中序列4所示的DNA分子；所述分子標記C為序列表中序列5所示的 DNA分子。
其中，序列3由786個核苷酸組成；序列4由677個核苷酸組成；序列5由475個核苷酸組成。
所述與小麥脂肪氧化酶活性相關的分子標記在檢測小麥脂肪氧化酶活性中的應用也屬于本發明的保護范圍。
本發明的另一個目的是提供一種檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法。
本發明所提供的檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法分為如下兩種
(一)單獨根據分子標記B——序列表中序列4所示的DNA分子，檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法具體可包括如下步驟
(I)鑒定待測小麥的基因組DNA中是否含有所述分子標記B ；
(2)按照如下方法確定所述待測小麥的脂肪氧化酶活性若所述待測小麥的基因組DNA中含有所述分子標記B，則所述待測小麥為脂肪氧化酶活性高的小麥或候選為脂肪氧化酶活性高的小麥；若所述待測小麥的基因組DNA中不含有所述分子標記B，則所述待測小麥為脂肪氧化酶活性低的小麥或候選為脂肪氧化酶活性低的小麥。
步驟(I)中，所述鑒定待測小麥的基因組DNA中是否含有所述分子標記B的方法如下以所述待測小麥的基因組DNA為模板，利用由序列表中序列I所示單鏈DNA和序列2 所示單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物；若所述PCR擴增產物中含有所述分子標記B，則所述待測小麥的基因組DNA中含有所述分子標記B ;若所述PCR產物中不含有所述分子標記B，則所述待測小麥的基因組DNA中不含有所述分子標記B。
(二)綜合根據分子標記A、B、C——序列表中序列3、4、5所示的DNA分子，檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法具體可包括如下步驟
(I)鑒定待測小麥的基因組DNA滿足如下(a)和(b)中的哪一種
(a)所述待測小麥的基因組DNA中同時含有所述分子標記A、所述分子標記B和所述分子標記C ；
(b)所述待測小麥的基因組DNA中含有所述分子標記A和所述分子標記C，同時不含所述分子標記B ；
(2)按照如下方法確定所述待測小麥的脂肪氧化酶活性若所述待測小麥的基因組DNA滿足所述(a)，則所述待測小麥為脂肪氧化酶活性高的小麥或候選為脂肪氧化酶活性高的小麥；若所述待測小麥的基因組DNA滿足所述(b)，則所述待測小麥為脂肪氧化酶活性低的小麥或候選為脂肪氧化酶活性低的小麥。
步驟(I)中，所述鑒定待測小麥的基因組DNA滿足(a)和(b)中的哪一種的方法如下以所述待測小麥的基因組DNA作為模板，利用由序列表中序列I所示單鏈DNA和序列2 所示單鏈DNA組成的弓I物對進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物；若所述PCR擴增產物中同時含有所述分子標記A、所述分子標記B和所述分子標記C，則所述待測小麥的基因組DNA滿足所述(a);若所述PCR擴增產物中含有所述分子標記A和所述分子標記C，同時不含有所述分子標記B，則所述待測小麥的基因組DNA滿足所述(b)。
上述兩種檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法中，確定所述PCR擴增產物中是否含有相應的分子標記的具體方法可為將所述PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，分別切除目的條帶進行膠回收后測序，通過測序結果進一步確定。
在上述兩個檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法中，所述PCR擴增的退火溫度具體為 55。。。
根據實際需要，在上述兩個檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法中，可將由序列I所示單鏈DNA和序列2所示單鏈DNA組成的引物對,替換為針對所述分子標記A或B或C在小麥基因組中的位置設計得到的其他可擴增得到含有所述分子標記A或B或C的DNA片段的引物對。
所述與小麥脂肪氧化酶活性相關的分子標記，或所述檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法在如下(al)_ (a6)中的應用也屬于本發明的保護范圍
(al)篩選脂肪氧化酶活性高的小麥品種；
(a2)篩選脂肪氧化酶活性低的小麥品種；
(a3)篩選耐儲藏小麥品種；
(a4)培育脂肪氧化酶活性高的小麥品種；
(a5)培育脂肪氧化酶活性低的小麥品種；
(a6)培育耐儲藏小麥品種。
本發明的再一個目的是培育耐儲藏小麥品種的方法。
本發明所提供的培育耐儲藏小麥品種的方法具體可包括采用通過上述兩個檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法中的任一個檢測得到的所述脂肪氧化酶活性低的小麥品種作為親本進行育種的步驟。
在本發明中，所有所述肪氧化酶活性高的小麥均為小麥籽粒脂肪氧化酶活性高于9. Onkat/g的小麥；所有所述肪氧化酶活性低的小麥均為小麥籽粒脂肪氧化酶活性低于7.lnkat/g的小麥。所述肪氧化酶活性的測定方法是以亞油酸為底物進行分光光度檢測。
本發明對148份小麥品種的統計實驗結果表明，同時含有所述分子標記A、B、C的小麥品種中有98. 29%為高脂肪氧化酶活性；含有所述分子標記A、C，同時不含有分子標記B 的小麥品種中有80. 06%為低脂肪氧化酶活性。利用該分子標記檢測小麥籽粒脂肪氧化酶活性方法可靠、簡便、實用，在小麥種質資源評價和育種的標記的輔助選擇中具有重要應用前景，同時為培育耐存儲的小麥品種提供了參考依據。
圖I為引物L0Xl-wp02對6個高LOX活性小麥品種和6個低LOX活性小麥品種 PCR擴增的電泳結果。其中，泳道M為DNA分子量標準；泳道01為小麥品種內鄉188 ;泳道 02為小麥品種周麥11 ;泳道03為小麥品種蒿優9409 ;泳道04為小麥品種淮麥19 ;泳道05 為小麥品種揚輻麥5242 ;泳道06為小麥品種安農9403 ;泳道07為小麥品種鄭麥9405 ;泳道08為小麥品種濟麥21 ;泳道09為小麥品種魯麥22 ;泳道10為小麥品種周麥16 ;泳道11 為小麥品種皖協497 ;泳道12為小麥品種鶴麥026。
圖2為條帶a、b、c (序列3、4、5)三條核酸序列的比較分析結果。其中，_為引物序列，為內含子區域。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
小麥品種(系)安農9267、宛抗18、安農95083-6-1、天禾0519、江白、Halberd、內白、Kantol07、Stardy、PH86-16、Gamenya、安農 04144、徐州 8913、華農 139 記載在“崔文禮， 姚大年，張文明等.138個小麥品種(系)戊聚糖含量的研究[J].中國糧油學報，2010，25(2): 11-17”中，公眾可從安徽農業大學獲得，用以重復本發明實驗。
小麥品種(系)安農95081-8、阜861-8記載在“王曉波，馬傳喜，何克勤等.小麥2D染色體上多酚氧化酶(PPO)基因STS標記的開發與應用[J].中國農業科學，2008，4(6) : 1583-1590”中，公眾可從安徽農業大學獲得，用以重復本發明實驗。
小麥品種(系)石農88，固鎮36-6-3-8記載在“鄭文寅，王慧，崔文禮等.104個小麥品種(系)脂肪氧化酶活性的研究[J].中國農業科學，2011，44 (9):1798-1805”中，公眾可從安徽農業大學獲得，用以重復本發明實驗。
小麥品種(系)揚06G86，07安徽03記載在“王慧，鄭文寅，樊宏等.不同小麥品種籽粒中LOX活性及基因型和環境互作分析[J],中國糧油學報，2011，26 (1):11_14”中，公眾可從安徽農業大學獲得，用以重復本發明實驗。
小麥品種(系)漯6112，豫展9804，阜98_46記載在“唐懷君，殷貴鴻，夏先春等.IBL · IRS特異性分子標記的篩選及其對不同來源小麥品種IRS易位染色體[J].作物學報，2009，35 (11):2107-2115”中，公眾可從安徽農業大學獲得，用以重復本發明實驗。
W1022，W1032是江蘇白火麥和關東107的雜交后代，公眾可從安徽農業大學獲得， 用以重復本發明實驗。
其余小麥品種為市面常售的商業化品種。
各小麥品種(系)于2010 2011年在安徽農業大學試驗農場種植,所有品種(系) 種在同一地塊，田間管理按常規進行。
實施例I、小麥籽粒脂肪氧化酶活性相關分子標記的獲得及其應用
一、小麥籽粒脂肪氧化酶活性性狀的測定
以表I中148份小麥作為實驗材料，參照Larisa Catod的分光光度計法，并加以適當改良后測定小麥籽粒中LOX活性。具體操作如下
(I)底物配制0. 5ml吐溫20溶解于IOml濃度為O. 05mol/L的pH9. O的硼酸緩沖液(配方-M O. 76g Na2BO4 · IOH2O, O. 124g H3BO3，用雙蒸水定容至200ml)中混勻，再逐滴加入O. 5ml亞油酸，混勻成乳濁液后加入I. 3ml濃度為lmol/L的NaOH水溶液至溶液澄清， 然后加入90ml濃度為O. 05mol/L的pH9. O的硼酸緩沖液，用HCl調節pH至7. O后定溶到 200ml ο
(2)酶提取液稱取O. 5克待測小麥籽粒粉，加入2. 5ml濃度為O. lmol/L的ρΗ7· 5 的磷酸緩沖液(配方-M 6g Na2HPO4 · 12Η20，0· 52g NaH2PO4 · 2H20，用雙蒸水定容至200ml) 在4°C條件下混勻30分鐘后在8000r/min 4°C下離心10分鐘，所得上清即為酶提取液。
(3)反應體系9· 5ml濃度為O. 05mol/L的ρΗ5· 6醋酸鈉緩沖液(配方取3. 73g無水醋酸鈉，I. 33ml醋酸,用雙蒸水定容至1000ml),加入O. 3ml步驟(I)配制的亞油酸底物, 加入60 μ I步驟(2)制備的酶提取液，用UV-1100型分光光度計(上海美譜達公司生產)在 234nm處用Icm光程的石英比色皿測定共軛過氧化物的吸光度，以空白的所述亞油酸底物作對照。每15秒記錄一個數據，觀察OD值的變化。
LOX 活性計算公式A=
/0. 01
式中A為酶活性單位，
OD (30S)為反應 30S 的 OD 值，
OD (15S)為反應 15S 的 OD 值，
O. 01為一個常數，即一分鐘內3ml的反應體系在234nm吸光度下增加O. 01作為一個酶活力單位。
(4)結果148份小麥籽粒的LOX活性測定結果如表I所示。
表I小麥籽粒LOX活性的測定結果及L0Xl-wp02擴增帶型
權利要求
1.與小麥脂肪氧化酶活性相關的分子標記，為序列表中序列4所示的DNA分子。
2.與小麥脂肪氧化酶活性相關的分子標記，由分子標記A、分子標記B和分子標記C組成；所述分子標記A為序列表中序列3所不的DNA分子；所述分子標記B為序列表中序列4 所不的DNA分子；所述分子標記C為序列表中序列5所不的DNA分子。
3.權利要求I或2所述的分子標記在檢測小麥脂肪氧化酶活性中的應用。
4.檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步驟(O鑒定待測小麥的基因組DNA中是否含有權利要求I所述分子標記；(2)按照如下方法確定所述待測小麥的脂肪氧化酶活性若所述待測小麥的基因組 DNA中含有權利要求I所述分子標記，則所述待測小麥為脂肪氧化酶活性高的小麥或候選為脂肪氧化酶活性高的小麥；若所述待測小麥的基因組DNA中不含有權利要求I所述分子標記，則所述待測小麥為脂肪氧化酶活性低的小麥或候選為脂肪氧化酶活性低的小麥。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟(I)中，所述鑒定待測小麥的基因組 DNA中是否含有權利要求I所述分子標記的方法如下以所述待測小麥的基因組DNA為模板，利用由序列表中序列I所示單鏈DNA和序列2所示單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物；若所述PCR擴增產物中含有權利要求I所述分子標記，則所述待測小麥的基因組DNA中含有權利要求I所述分子標記；若所述PCR產物中不含有權利要求I 所述分子標記，則所述待測小麥的基因組DNA中不含有權利要求I所述分子標記。
6.檢測小麥脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步驟Cl)鑒定待測小麥的基因組DNA滿足如下(a)和(b)中的哪一種(a)所述待測小麥的基因組DNA中同時含有權利要求2中所述分子標記A、所述分子標記B和所述分子標記C ；(b)所述待測小麥的基因組DNA中含有權利要求2中所述分子標記A和所述分子標記 C，同時不含所述分子標記B;(2)按照如下方法確定所述待測小麥的脂肪氧化酶活性若所述待測小麥的基因組 DNA滿足所述(a)，則所述待測小麥為脂肪氧化酶活性高的小麥或候選為脂肪氧化酶活性高的小麥；若所述待測小麥的基因組DNA滿足所述(b)，則所述待測小麥為脂肪氧化酶活性低的小麥或候選為脂肪氧化酶活性低的小麥。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于步驟(I)中，所述鑒定待測小麥的基因組 DNA滿足(a)和(b)中的哪一種的方法如下以所述待測小麥的基因組DNA作為模板，利用由序列表中序列I所示單鏈DNA和序列2所示單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增，獲得 PCR擴增產物；若所述PCR擴增產物中同時含有權利要求2中所述分子標記A、所述分子標記B和所述分子標記C，則所述待測小麥的基因組DNA滿足所述(a);若所述PCR擴增產物中含有權利要求2中所述分子標記A和所述分子標記C，同時不含有所述分子標記B，則所述待測小麥的基因組DNA滿足所述(b )。
8.權利要求I或2所述的分子標記或權利要求4-7中任一所述的方法在如下 (al>- (a6)中的應用(al)篩選脂肪氧化酶活性高的小麥品種；(a2)篩選脂肪氧化酶活性低的小麥品種；(a3)篩選耐儲藏小麥品種；(a4)培育脂肪氧化酶活性高的小麥品種；(a5)培育脂肪氧化酶活性低的小麥品種；(a6)培育耐儲藏小麥品種。
9.培育耐儲藏小麥品種的方法，包括采用通過權利要求4-7中任一所述方法檢測得到的所述脂肪氧化酶活性低的小麥品種作為親本進行育種的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種與小麥脂肪氧化酶活性相關的分子標記及其應用。本發明所提供的分子標記為如下(a)或(b)(a)序列表中序列4所示的DNA分子；(b)由分子標記A、分子標記B和分子標記C組成；所述分子標記A為序列表中序列3所示的DNA分子；所述分子標記B為序列表中序列4所示的DNA分子；所述分子標記C為序列表中序列5所示的DNA分子。實驗證明，同時含有所述分子標記A、B、C的小麥品種中有98.29%為高脂肪氧化酶活性；含有所述分子標記A、C，同時不含有分子標記B的小麥品種中有80.06%為低脂肪氧化酶活性。本發明在小麥種質資源評價和育種的標記的輔助選擇中具有重要應用前景，同時為培育耐存儲的小麥品種提供了參考依據。
文檔編號A01G1/00GK102936594SQ20121044533
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者鄭文寅, 吳萍, 司紅起, 張文明, 姚大年 申請人:安徽農業大學