維甲酸誘導干細胞分化的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及維甲酸的新用途，具體涉及維甲酸作為干細胞誘導分化劑中的用途。
【背景技術】
[0002] 胚胎干細胞能被誘導分化為多種不同種類的細胞，比如神經細胞、心肌細胞、生殖 細胞、骨細胞、脂肪細胞等 [1]。目前，干細胞的體外誘導系統被廣泛研究，多種誘導物被發現 能誘導干細胞進行體外分化，包括 PDGF、BMP2、BMP4、Activin A、bFGF、Wnt3a、RA、FGF、DMS0 和 TGF-bl 等[24].
[0003] 維甲酸（RA)是維生素A的衍生物，其已被發現能誘導小鼠胚胎干細胞向生殖細胞 分化 [7]。特別之處在于，RA能顯著刺激StraS的表達，這是RA干預干細胞后的標志事件M。
[0004] 前期研究中發現，齊墩果酸（0A)和維甲酸（RA)對小鼠胚胎干細胞 1B10(MESC-1B10)具有相似的作用：能誘導MESC-1B10向雌性和雄性生殖細胞分化，但是同 時發現兩者對于小鼠胚胎干細胞D3(MESC-D3)的影響不同：0A能誘導MESC-D3向雌性和雄 性生殖細胞分化，而RA不能誘導MESC-D3向生殖細胞分化 [11]。根據前期的試驗可以看出， 不同的小鼠胚胎干細胞對于RA具有不同反應。
[0005] 小鼠胚胎干細胞R1/E(MESC-R1/E)細胞株于1991年八月被建立，來源于小鼠 129X1品系與129S1品系交配后形成的3. 5天齡的囊胚，它的性別為雄性，同時這株細胞被 表明能形成生殖細胞[21]。它與MESC-1B10、MESC-D3屬于小鼠干細胞的不同細胞株，它們之 間具有不同的遺傳背景。
[0006]目前還未見維甲酸對小鼠胚胎干細胞R1/E誘導分化的報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供維甲酸作為誘導小鼠胚胎干細胞R1/E干細胞分化劑中的 用途。
[0008] 本發明提供了維甲酸或其藥學上可接受的鹽、酯或水合物在制備將小鼠胚胎干細 胞R1/E定向分化為雌性生殖細胞的誘導分化劑中的用途。
[0009] 誘導分化劑，即誘導細胞分化的物質，這種物質可以是單一化合物，也可以是多種 成分的組合，其存在或使用的形式可以是固體、半固體，也可以是液體。
[0010] 進一步地，所述藥學上可接受的鹽為維甲酸與金屬離子或酸形成的鹽。
[0011] 其中，金屬離子成鹽形式多采用維甲酸與金屬離子形成的鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、 鋅鹽等，常用的成鹽手段是將維甲酸與相應堿反應制備而成；除與金屬離子成鹽外，維甲酸 還可以與酸成鹽，包括藥學上常見的有機酸或無機酸，如鹽酸鹽、硫酸鹽、枸櫞酸鹽、苯磺酸 鹽、氫溴酸鹽、氫氟酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、 酒石酸鹽等。
[0012] 進一步地，所述藥學上可接受的酯為維甲酸與C1-C4醇形成的酯。
[0013] 其中，所述C1-C4醇為甲醇或乙醇。
[0014] 進一步地，所述誘導分化劑是上調〇^-9、3廿&8、30?3、]\^1、2?1、2?2、2?3基因表 達、下調Itag6、Itgbl基因表達的誘導分化劑。
[0015] 其中，將小鼠胚胎干細胞R1/E定向分化為雌性生殖細胞的具體操作步驟為：
[0016] a、取小鼠胚胎干細胞R1/E ;
[0017] b、置于含有的維甲酸或其藥學上可接受的鹽、酯或水合物的培養液中培養，培養 時間不低于72小時，即得雌性生殖細胞。
[0018] 進一步地，步驟b所述培養液中維甲酸或其藥學上可接受的鹽、酯或水合物的含 量以維甲酸計為3i!g/ml。
[0019] "含量以維甲酸計"，表明維甲酸藥學上可接受的鹽、酯或水合物在培養液中的含 量也通過維甲酸進行換算。
[0020] 進一步地，步驟b中，所述培養時間為72小時。
[0021] 本發明還提供了一種將小鼠胚胎干細胞R1/E定向分化為雌性生殖細胞的方法， 它包括如下操作步驟：
[0022] a、取小鼠胚胎干細胞R1/E ;
[0023] b、置于含有的維甲酸或其藥學上可接受的鹽、酯或水合物的培養液中培養，培養 時間不低于72小時，即得雌性生殖細胞。
[0024] 進一步地，步驟b所述培養液中維甲酸或其藥學上可接受的鹽、酯或水合物的含 量以維甲酸計為3i!g/ml。
[0025] 進一步地，步驟b中，所述培養時間為72小時。
[0026] 本發明研究表明，RA能誘導MESC-R1/E向雌性生殖細胞分化，但不能向雄性生殖 細胞分化，可以將RA或其藥學上可接受的鹽、酯或水合物作為將小鼠胚胎干細胞R1/E定向 分化為雌性生殖細胞的誘導分化劑使用。
[0027] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0028] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0029] 圖1MESC-R1/E的生長代表圖。"鳥巢"狀的克隆明顯可見。圖中標尺代表200iim。
[0030] 圖2MESC-R1/E形成的EB的代表圖，球型的EB可明顯可見。圖中標尺代表200iim。
[0031] 圖3幾種不同化合物干預后的EB貼壁生長的代表圖（a = RA、b = DMS0、）.圖中 標尺代表200 u m。
【具體實施方式】
[0032] 本發明所述維甲酸結構式如下：
[0033]
[0034] 實施例1維甲酸對干細胞的影響
[0035] 1、材料和方法
[0036] 1. 1MESC-R1/E和干細胞培養
[0037] MESC-R1/E(ATCC No. :SCRC-1036)購買自上海生物化學和細胞研究所。飼養層細 胞采用小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3。NIH3T3的培養液為DMEM (含2mmol/L L-glu和4. 5g/L glucose)(成都哈里，中國），含10%胎牛血清（Sigma,美國），含100U/ml青霉素和0. lmg/ ml鏈霉素（Gibco,美國）。
[0038] 培養見113了3至90%豐度；加入絲裂霉素(：(318111&，美國）至終濃度為1〇1^/ ml，培養物被放入細胞培養箱37°C孵育3小時，而后磷酸緩沖液洗五遍；在培養物中接種 MESC-R1/E，每天換液；4到7天后，干細胞克隆將形成。
[0039] 1. 2擬胚體（EB)形成和貼壁生長
[0040]EB的分化誘導液配方與MESC-R1/E的培養液一樣，只是沒有LIF因子。為了形成 EB，首先使用胰蛋白酶（Gibco,美國）消化MESC-R1/E培養物；3分鐘后，上下吹打細胞至 單個；然后為了分離MESC-R1/E和飼養層細胞NIH3T3,靜置混合物30分鐘；接著，吸取上清 液，接種到具有超低吸附底部的培養板（Corning，美國），繼續培養；24小時后，EB將形成； 再過24小時后，收集EB。
[0041] 1.3RA的誘導分化
[0042] RA購自Sigma(貨號：R2625)。收集到的EB被接種于具有普通底部的培養板；EB 在24小時內貼壁；24小時后，分別在對應孔中加入RA、二甲基亞砜（DMS0)。DMS0是陰性對 照，RA使用DMS0配制。RA的終濃度為3 ii g/ml，DMS0的終濃度為0. 1 %。3 ii g/ml RA相當 于10 5M RA。化合物干預72小時后，進行顯微照像，以比較細胞形態的變化。
[0043] 1.4qPCR 分析
[0044]干預 72 小時后，使用 Tri Reagent (Molecular Research Center，美國）?提取 RNA ;然后合成 cDNA，cDNA 合成試劑盒為 Revertaid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，美國）；最后進行 qPCR 檢測，使用 iQ Sybr Green Supermix(Bi〇-Rad，美 國）。qPCR檢測了 11種生殖分化相關基因的表達模式。表1列出了引物的名稱和序列。 3 -actin被選定為內參基因。
[0045] 表1 11種生殖相關基因的名稱和序列
[0046]
[0047] 2?統計學分析
[0048] 軟件SPSS13. 0被用來進行統計學分析。不同化合物的干預結果被用來與DMS0的 數據比較，比較采用獨立樣本T檢驗。P〈0. 05被認為差異顯著。
[0049] 3?結果
[0050] 3. 1MESC-R1/E在飼養層細胞上生長正常：
[0051] 為了保持MESC-R1/E的分化潛能，選定NIH3T3為飼養層細胞。圖1顯示MESC-R1/ E生長情況的代表圖。"鳥巢"狀的克隆明顯可見，這與前期報道的一致。
[0052] 3. 2EB在超低吸附細胞培養孔中形成：
[0053] 將培養的MESC-R1/E消化脫吸附，再吹打成單個細胞，然后細胞懸液接種于具有 超低吸附底部的細胞培養板繼續培養。EB于24小時后形成。圖2是由MESC-R1/E形成的 EB的代表圖，球型的EB可明顯可見，這與前期報道一致。
[0054] 3. 3貼壁生長后的EB在由RA、DMS0干預后有不同形態：
[0055] EB被接種于具有普通吸附底部的培養板。24小時后，EB貼壁，然后RA、DMS0等被 分別加入相應的干預孔。72小時后，對細胞孔進行顯微照像，以比較細胞形態的變化。圖 3表明：RA干預孔細胞形態不同于DMS0干預孔，對于RA干預孔，細胞團周圍的死亡細胞較 少，而對于DMS0干預孔，細胞團周圍的死亡細胞較多。
[0056] 3. 4各個化合物干預對11種生殖分化相關基因表達模式的影響：
[0057] 選定了 11種生殖分化相關基因為實驗檢測對象：0ct-4、⑶F-9、Stra8、SCP3、Mvh、 ZP1、ZP2、ZP3、Itga6、Itgbl、TP2。Oct-4對于維持干細胞的多分化潛能重要，表達太少或 者太多都容易導致干細胞分化 [12'13]。GDF-9是向雌性生殖細胞分化的早期標記基因[14]。 StraS是向雄性生殖細胞分化的早期標記基因 [15]。SCP3是減數分裂的早期標記基因[16]。 Mvh是向雌性生殖細胞分化和向雄性生殖細胞分化的早期標記基因 [17]。ZP1、ZP2、ZP3是卵 細胞形成的標志基因[18]。Itga6、Itgb、TP2是精子細胞形成的標志基因 [19'2°]。
[0058] 對于被RA、DMS0干預的細胞，檢測了它們11種生殖分化相關基因的表達模式。來 自RA干預的數據，與來自DMS0的干預的數據進行了比較。表2顯示了比較的結果。
[0059] 表2 RA對11種生殖分化相關基因的表達模式的影響
[0060]
[0061]表2表明：RA顯著上調了⑶F-9、Stra8、SCP3、Mvh、ZP1、ZP2、ZP3(P=0? 0001、 0? 0059、0. 0015、0. 0001、0. 0211、0. 0001、0. 0005)，顯著下調了Itag6、Itgbl(P = 0.0041、 0.0000),同時非顯著下調了Oct-4,非顯著上調了TP2。
[0062] 上述結果說明：RA能誘導小鼠胚胎干細胞R1/E向雌性生殖細胞分化。
[0063] 4 討論
[0064] MESC-1B10、MESC-D3和MESC-R1/E均為小鼠胚胎干細胞的不同細胞株，它們具有 不同的遺傳背景。如MESC-R1/E細胞株于1991年八月被建立，來源于小鼠129X1品系與 129S1品系交配后形成的3. 5天齡的囊胚，它的性別為雄性，同時這株細胞被表明能形成生 殖細胞[21]。而 MESC-D3(ATCC No. :CRL-11632)的品源為 129/Sv+c/+p，來源于 3. 5 天齡囊 胚，這株細胞能被注射入囊胚而繼續分化為生殖細胞[22]。
[0065] 在前期研究中[11]，RA被發現都能誘導MESC-1B10向生殖細胞分化，但是RA卻不 能誘導MESC-D3向生殖細胞分化。然而，在本研究中，RA被發現僅能誘導MESC-R1/E向雌 性生殖細胞分化，不能誘導其向雄性生殖細胞分化。由此可見，小鼠胚胎干細胞的不同細胞 株對于RA的反應性是不同的。
[0066] 在本研究中，所有化合物的干預時間被選定為72小時，因