新型誘導多能干細胞體外定向分化成晶狀體小體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞生物學技術領域，具體是一種體外誘導晶狀體小體的制備方法。
【背景技術】
[0002]多能干細胞(pluripotent stem cells)包括胚胎干細胞(ESCs)和誘導性多能干細胞(iPSCs)兩類，是具有多分化潛能的細胞，理論上來說可以分化成任意一類細胞，將多能干細胞注射到免疫抑制的小鼠內可形成具有內中外三個胚層的畸胎瘤。
[0003]多能干細胞在藥物研究、疾病機制研究及再生移植領域都有非常重要的作用。國內外已有學者利用多能干細胞定向誘導分化成特定的細胞或組織前體，作為藥物毒性篩選原料，成為臨床試驗的第一步。在再生醫學領域，國內外學者甚至已成功利用多能干細胞技術聯合體外定向分化以及體內注射等手段在視網膜退行性病變、角膜病變、肝臟損害、心肌損害等多種疾病上實現了再生移植治療。為疾病的機制研究和治療提供了新的思路。
[0004]先天性白內障是造成兒童失明和視力損害的重要原因，任何直接或間接參與、影響晶狀體發育的基因突變都可能導致先天性白內障的發生。因此，明確先天性白內障的發病機制對于治療及預防先天性白內障的發生發展具有重要的意義。將多能干細胞中的iPSCs技術和體外晶狀體誘導技術結合，可以獲得先天性白內障患者特異性的多能干細胞及晶狀體，國際上將體外形成的晶狀體稱之為晶狀體小體，通過觀察和檢測晶狀體小體發生發展過程中各類基因、蛋白的表達變化可以更直觀的描述其發病過程，為發病機制的研究提供更有力的證據，同時也為基因治療提供了理論基礎。
[0005]年齡相關性白內障為全球首位致盲眼病之一，目前尚無預防及早期治療的有效的藥物，而相關有效研究模型的缺乏是藥物研究面臨的最大障礙，如現有細胞模型無法在藥物釋放、作用以及跟體內微環境互相作用等方面無法真實反映藥物在體內的作用情況；而動物模型則與人體之間存在不可避免的種族差異，因此很難構建合適的藥物篩選模型。白內障摘除聯合人工晶體植入術是治療白內障最常用且迄今為止效果較為理想的方法，但人工晶體存在的局限性以及術后后囊膜混濁的發生均在一定程度上影響了患者的視覺質量，限制了人工晶體的進一步發展。總結來言，白內障作為全球首位的致盲性眼病，其發病機制、疾病預防及早期治療、再生晶體的研究及運用由于有效模型的缺乏而停滯不前。
[0006]目前國內外已有研究小組在動物實驗中通過將晶狀體囊袋放置在房水中培養獲得有初步晶狀體結構的小體，但由于材料來源的限制而無法過渡到人晶狀體上。在人晶狀體發育研究中，有研究團隊實現了在體外誘導胚胎干細胞定向分化成晶狀體上皮細胞及晶狀體纖維細胞，這個定向分化的過程部分再現了晶狀體的發育過程，但其應用都由于無法形成形態良好具備光學功能的晶狀體小體而受到限制。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是克服上述【背景技術】中的不足，提供一種新型誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法及應用，該方法應能形成形態良好且具備光學功能的晶狀體小體；獲得的晶狀體小體可用于晶狀體胚胎發育機制的研究、先天性白內障發病機制的研究以及白內障相關藥物篩選。
[0008]本發明提供技術方案是:
[0009]新型誘導多能干細胞定向分化成晶狀體小體的方法，包括以下步驟:
[0010](I)將多能干細胞定向誘導分化成初級神經外胚層細胞團
[0011]將多能干細胞接種到基質膠溶液包被的六孔板上，用含人生長因子noggin的mTesR培養液培養5-7天后形成初級神經外胚層細胞團；所述基質膠溶液由胚胎干細胞基質膠溶解在DMEM/F12培養液后形成，胚胎干細胞基質膠的體積比例為0.8-1.2% ;
[0012](2)分離挑選初級神經外胚層細胞團
[0013]用乙二胺四乙酸溶液消化初級神經外胚層細胞團，然后用機械法將初級神經外胚層細胞團周邊的數層神經外胚層細胞挑出；
[0014](3)誘導神經外胚層細胞定向分化為初級晶狀體小體
[0015]將挑出的神經外胚層細胞團接種到新的基質膠溶液包被的六孔板中，用含人生長因子bFBF、BMP4、BMP7的mTesR培養液培養5_7天并且每日更換培養液，保留出現“荷包蛋樣”細胞排列結構的神經外胚層細胞團，其余細胞團剔除，繼續培養8-10天后即可獲得初級晶狀體小體；所述新的基質膠溶液由胚胎干細胞基質膠溶解在DMEM/F12培養液后形成，胚胎干細胞基質膠的體積比例為0.8-1.2% ;
[0016](4)誘導初級晶狀體小體分化為成熟的晶狀體小體
[0017]用含人生長因子bFBF、Wnt3a的mTesR培養液培養初級晶狀體小體，并且每日更換mTesR培養液，9-11天后即可獲得由囊膜、晶狀體上皮細胞、晶狀體初級纖維細胞及晶狀體成熟纖維細胞構成的晶狀體小體。
[0018]所述步驟(I)中，mTesR培養液中含有90_110ng/ml的人生長因子noggin。
[0019]所述步驟⑵中的乙二胺四乙酸溶液，是在PBS中加入乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸含量為0.4-0.6mM，并且加入氯化鈉使乙二胺四乙酸溶液的滲透壓為320-360m0sm。
[0020]所述步驟(2)中挑出的神經外胚層細胞團為5-10層的內層細胞、3-7層的中層細胞以及3-7層的外層細胞。
[0021]所述步驟(3) “荷包蛋樣”細胞排列結構的神經外胚層細胞團，其結構為外層數十層分化的上皮樣細胞，細胞體積較中央區細胞明顯增大，胞質多，細胞排列相對疏松，中央區細胞體積小排列緊湊，胞質少，兩類細胞相接形成類似荷包蛋的結構。
[0022]所述步驟(3)中，mTesR培養液中含有 17_23ng/ml 的 BMP4、17_23ng/ml 的 BMP7、80-120ng/ml的bFBF ;所述步驟(4)中，mTesR培養液中含有17_23ng/ml的Wnt3a以及80-120ng/ml 的 bFBF。
[0023]所述的晶狀體小體呈現透明的3D結構，為圓形或橢圓形，直徑l_3mm，表達晶狀體特異性蛋白包括a -A、α -B、β、γ四種晶狀體蛋白以及水通道蛋白ΜΙΡ。
[0024]所述的α -Α、α -B、β、γ四種晶狀體蛋白為晶狀體纖維細胞的結構蛋白，水通道蛋白MIP為表達在晶狀體上皮細胞以及晶狀體纖維細胞細胞膜上的通道蛋白。
[0025]所述的囊膜為晶狀體外層包繞的一層透明薄膜，晶狀體上皮細胞為囊膜下的僅有的一層柱狀或立方狀上皮細胞，初級晶狀體纖維細胞為部分細胞器細胞核開始退化的由晶狀體上皮細胞分化而來的纖維細胞，成熟晶狀體纖維細胞為胞內細胞器細胞核完全退化由初級晶狀體纖維細胞分化而來的細胞。
[0026]所述方法獲得的晶狀體小體，用于晶狀體胚胎發育機制的研究、先天性白內障發病機制的研究以及白內障相關藥物篩選。
[0027]本發明的有益效果是:
[0028]本發明通過脫離飼養細胞利用不同生長因子組合配伍分化早期外胚層細胞團的分離挑選純化來實現的，突破了既往晶狀體小體結構上的限制，獲得了具有3D立體結構的晶狀體小體且其直徑可達到l_3mm，并具有初步的光學功能、良好的透光性和一定放大比率，在結構和光學功能上更接近于人類晶狀體的體外晶狀體，在晶狀體體外誘導上完成了質的飛躍，建立了一個更完善的穩定的晶狀體體外發育模式；因此，本方法可以用于晶狀體發育機制、白內障發病機制、白內障治療藥物以及再生晶體的研究，具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0029]圖1為晶狀體小體J的攝像圖。
[0030]圖2-1為晶狀體小體中晶狀體蛋白a -A的mRNA表達的RT-qPCR結果圖。
[0031]圖2-2為晶狀體小體中晶狀體蛋白α -B的mRNA表達的RT-qPCR結果圖。
[0032]圖2-3為晶狀體小體中晶狀體蛋白β的mRNA表達的RT-qPCR結果圖。
[0033]圖2-4為晶狀體小體中晶狀體蛋白γ的mRNA表達的RT-qPCR結果圖。
[0034]圖2-5為晶狀體小體中水通道蛋白MIP的