對應于轉基因事件kk179-2的苜蓿植物和種子及其檢測方法

對應于轉基因事件kk179-2的苜蓿植物和種子及其檢測方法
【專利摘要】本發明提供了轉基因苜蓿事件KK179-2。本發明還提供了與所述事件相關的細胞、植物部分、種子、植物、商品以及對于所述事件是獨特的并且通過將轉基因DNA插入苜蓿植物的基因組來產生的DNA分子。本發明進一步提供了用于檢測所述苜蓿事件核苷酸序列在樣本中的存在的方法，用于檢測診斷所述苜蓿事件的存在的核苷酸序列的探針和引物。
【專利說明】對應于轉基因事件KK179-2的苜蓿植物和種子及其檢測方
法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請根據35U.S.C.§ 119(e)有權要求于2011年6月30日提交的美國臨時專利申請號61/503，373和2012年6月26日提交的美國臨時專利申請號61/664，359的優先權，所述美國臨時專利申請的公開內容通過引用整體并入本文。
[0003]序列表的并入
[0004]稱為“57978_seq_listing.txt” 的序列表為 10，564 字節(在 MS-WINDOWS 中測量)，以電子形式提交，創建于2012年5月I日，并且通過引用并入本文。
發明領域
[0005]本發明涉及苜蓿轉基因事件KK179-2。本發明還提供了與所述事件相關的細胞、植物部分、種子、植物、商品，以及對于事件是獨特的并且通過將轉基因DNA插入苜蓿植物的基因組來產生的DNA分子。本發明進一步提供了用于檢測所述苜蓿事件核苷酸序列在樣本中的存在的方法，用于檢測診斷所述苜蓿事件的存在的核苷酸序列的探針和引物。
[0006]發明背景
[0007]苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培最多的豆類作物，其中美國是頭號苜蓿生產國。生物技術的方法已應用于苜蓿以改善產品的農藝性狀和質量。一種這樣的農藝性狀是增加的木質素含量。·
[0008]木質素是第二豐富的陸地生物聚合物且占有機碳的30%。木質素對于細胞壁的結構完整性是至關重要的并且其賦予莖硬度和強度。木質素含量與奶牛的飼料消化率逆相關。可通過表達能夠提供木質素的減少并且同時提供增加的苜蓿消化率的RNA抑制構建體來在轉基因植物中獲得此類減少。已知外源基因或抑制分子在植物中的表達受很多因素影響，這些因素例如使用的調控元件、轉基因插入物的染色體定位、靠近轉基因插入位點的任何內源調控元件的接近度(proximity)、以及環境因素例如光和溫度。例如，已觀察到在類似產生的事件之間在轉基因抑制的總體水平上或轉基因抑制的空間或時間模式上存在變化。為此原因，通常必需篩選數百個獨立轉化事件以最終鑒定對于商業農業目的有用的一個事件。一旦被鑒定為具有期望的抑制表型、分子特征和改善的性狀，那么可使用植物育種方法將這樣的事件用于將該改善的性狀滲入其他遺傳背景。所得的后代可含有轉基因事件，并且因此可具有原始轉化體的該性狀的相同特征。這可用于產生許多不同的包含改良的性狀并且經適當地改造適合于特定地方生長條件的作物品種。
[0009]能夠檢測特定植物的轉基因/基因組DNA的存在以便確定有性雜交的后代是否含有所關注的轉基因/基因組DNA將是有利的。此外，用于檢測特定植物的方法當遵守需要上市前批準和標記來源于轉基因作物植物的食品的規程時將是有用的。
[0010]抑制元素的存在或不存在可通過任何公知的核酸檢測方法例如聚合酶鏈式反應(PCR)或使用核酸探針的DNA雜交來檢測。這些檢測方法一般集中于常用的遺傳元件例如啟動子、終止子、標記基因等。這樣，此類方法可能不用于區分不同轉化事件，特別是使用相同DNA構建體產生的那些，除非鄰近插入DNA(“側翼DNA”)的染色體DNA的序列是已知的。事件特異性 PCR 測定例如由 Tavemiers 等(J.Agric.Food Chem.,53:3041-3052, 2005)進行了討論，其中顯示了轉基因玉米品系Btll、Btl76和GA21以及油菜(canola)事件GT73的事件特異性跟蹤系統。在該研究中，基于每個事件的基因組/轉基因接合處的序列設計事件特異性引物和探針。轉基因植物事件特異性DNA檢測方法也在美國專利號7，632，985 ；7，566，817 ;7，368，241 ;7，306，909 ;7，718，373 ;7，189，514,7, 807，357 和 7，820，392 中描述。
[0011]發明概述
[0012]本發明為命名為事件KK179-2的苜蓿轉基因事件，其具有以登錄號PTA-11833保藏于美國典型培養物保藏中心(ATCC)的代表性種子樣本。
[0013]本發明提供了植物、種子、細胞、后代植物或植物部分，它們包含來源于包含事件KK179-2的植物、細胞、植物部分或種子的事件。本發明因此包括，但不限于花粉、胚珠、花、牙、根和葉。
[0014]本發明的一個方面提供了用于檢測來自苜蓿事件KKl79-2植物或種子的DNA轉基因/基因組接合區域的存在的組合物和方法。提供了包含選自SEQ ID NO=USEQ ID NO:2及其互補序列的至少一個轉基因/基因組接合DNA分子的DNA分子，其中接合分子橫跨插入位點。苜蓿事件KK179-2和包含這些DNA分子的種子是本發明的方面。
[0015]提供了來自苜蓿事件KK179-2的DNA轉基因/基因組區域SEQID NO:3或其`互補序列的新穎DNA分子。其基因組中包含SEQ ID NO:3的苜蓿植物和種子為本發明的方面。在本發明的另一方面，提供了為DNA轉基因/基因組區域SEQ ID NO:4或其互補序列的DNA分子，其中該DNA分子在苜蓿事件KK179-2中是新穎的。其基因組中包含SEQ ID NO:4的苜蓿植物和種子為本發明的方面。
[0016]本發明提供了涉及事件KK179-2的DNA分子。這些DNA分子可包含代表或來源于如下的核苷酸序列:事件KK179-2的轉基因插入與側翼基因組DNA的接合處、和/或位于插入DNA側翼的基因組DNA的區域、和/或位于插入位點側翼的所整合的轉基因DNA的區域、和/或所整合的轉基因表達盒的區域、和/或任何此類區域的連續序列。本發明還提供了用作診斷該事件的引物和探針的DNA分子。提供了包含這些分子的植物、細胞、植物部分、商品、后代和種子。
[0017]根據本發明的一個方面，提供了用于檢測來自命名為KK179-2的新型苜蓿植物的轉基因/基因組插入區域的存在的組合物和方法。提供了DNA序列，其包含選自SEQ ID NO:
I(對應于 SEQ ID NO:6 的位置 1038 至 1057，圖1 [F])和 SEQ ID N0:2(對應于 SEQ ID NO:6的位置3620至3639，圖1[F])及其互補序列的KK179-2的至少一個接合序列；其中接合序列為橫跨插入到基因組中的異源DNA與苜蓿細胞基因組DNA連接的點的核苷酸序列并且在含有苜蓿DNA的生物樣本中該序列的檢測診斷苜蓿事件KK179-2DNA在所述樣本中的存在(圖1)。苜蓿事件KK179-2和包含這些DNA分子的苜蓿種子為本發明的方面。
[0018]根據本發明的另一方面，提供了用于DNA檢測方法的兩個DNA分子，其中第一 DNA分子包含具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的DNA分子的轉基因區域的任何部分的足夠長度的連續多核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸，并且第二 DNA分子包含SEQ ID NO:3的5’側翼苜蓿基因組DNA區域的任何部分的類似長度的多核苷酸，其中所述DNA分子用作DNA引物，當所述DNA引物與來源于事件KK179-2的模板一起用于擴增反應時以產生診斷樣本中的事件KK179-2DNA的擴增子。由與SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的任何部分同源或互補的DNA引物產生的任何擴增子以及包含SEQ IDNO:1的任何擴增子為本發明的方面。
[0019]根據本發明的另一方面，提供了用于DNA檢測方法的兩個DNA分子，其中第一 DNA分子包含具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的DNA分子的轉基因區域的任何部分的足夠長度的連續多核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸，和包含SEQ ID NO:4的3’側翼苜蓿基因組DNA的任何部分的類似長度的第二 DNA分子，其中所述DNA分子用作DNA引物，當所述DNA引物與來源于事件KK179-2的模板一起用于擴增反應時以產生診斷樣本中的事件KK179-2DNA的擴增子。由與SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的任何部分同源或互補的DNA引物產生的任何擴增子、以及包含SEQ ID NO:2的任何擴增子為本發明的方面。
[0020]本發明提供了用于檢測來源于苜蓿事件KK179-2的DNA的存在的方法、組合物和試劑盒。某些方法包括(a)將包含DNA的樣本與引物組接觸，所述引物組當與來自苜蓿事件KK179-2的基因組DNA用于核酸擴增反應時產生診斷該事件的擴增子；(b)進行核酸擴增反應，從而產生擴增子；以及(c)檢測擴增子，其中所述擴增子包含SEQID NO:1和/或SEQ ID N0:2。本發明還提供了通過如下步驟檢測該事件的方法:(a)將包含DNA的樣本與探針接觸，所述探針當與來自事件的基因組DNA用于雜交反應時與對事件特異的DNA分子雜交；(b)使樣本和探針經受嚴格雜交條件；以及(c)檢測探針與DNA分子的雜交。還提供了包含用于檢測來源于事件的DNA的存在的本發明的方法和組合物的試劑盒。
[0021]本發明進一步提供了產生苜蓿植物的方法，其包括:(a)將KK179-2苜蓿植物與第二苜蓿植物雜交，從而產生種子；(b)使所述種子生長以產生多個后代植物；以及(C)選擇包含KK179-2的后代植物或具有減少的木質素含量的后代植物。
[0022]本發明的前述和其他方面將從以下詳述而變得更加顯而易見。
[0023]附圖簡述
[0024]圖1.苜蓿事件KK17 9-2的基因組中的轉基因插入物的圖解表示；[A]對應于SEQID NO:1的相對位置，其形成SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5之間的接合處；[B]對應于SEQID NO:2的相對位置，其形成SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5之間的接合處；[C]對應于SEQIDNO:3的相對位置，其含有苜蓿基因組側翼區域和轉基因DNA插入物的任意指定的5’末端的一部分；[D]對應于SEQ ID NO:4的相對位置，其含有苜蓿基因組側翼區域和轉基因DNA插入物的任意指定的3’末端的一部分；[E]表示SEQ ID N0:5，其為包括整合到事件KK179-2的基因組中的CCOMT抑制盒的轉基因DNA插入物的序列；[F]表示SEQ ID NO:6，其為包含如圖中從左到右表示的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:4的連續序列，其中SEQID NO:1和SEQ ID NO:2如上所述并入，因為這些序列存在于事件KK179-2的基因組中。LB:是指T-DNA的左邊界；RB:是指T-DNA的右邊界。
[0025]序列簡述
[0026]稱為“57978_seq_listing.txt” 的序列表為 10，564 字節(在 MS-WINDOWS 中測量)，以電子形式提交，創建于2012年5月I日，并且通過引用并入本文。
[0027]SEQ ID NO: 1-代表苜蓿基因組DNA與所整合的DNA插入物之間的左邊界接合處的20bp核苷酸序列。該序列對應于SEQ ID NO:6的位置1038至1057，并且對應于SEQ IDNO:3的位置1038至1047(圖1的[C])。此外，SEQ ID NO:1對應于在SEQ ID NO:5的位置I至10處的表達盒的所整合的左邊界(圖1的[E])。
[0028]SEQ ID NO:2_代表所整合的DNA插入物和苜蓿基因組DNA之間的右邊界接合處的20bp核苷酸序列。該序列對應于SEQ ID NO:6的位置3620至3639，并且對應于SEQ IDNO:4的位置91至111(圖1的[D])。此外，SEQ ID NO:2對應于SEQ ID NO:5的位置2573至 2582(圖1 的[E])。
[0029]SEQ ID NO:3_包括位于事件KK179-2的插入DNA側翼的5’苜蓿基因組序列(1047bp)加上所整合的DNA的區域(IOObp)的1147bp核苷酸序列。該序列對應于SEQ IDNO:6的位置I至1047。
[0030]SEQ ID NO:4_包括位于事件KK179-2的插入DNA側翼的3’苜蓿基因組序列(1256bp)加上所整合的DNA的區域(IOObp)的1356bp核苷酸序列。該序列對應于SEQ IDNO:6 的位置 3529 至 4885。
[0031]SEQ ID NO:5_所整合的表達盒的序列，包括整合后的左和右邊界序列。SEQ IDNO:5對應于SEQ ID NO:6的核苷酸位置1048至3629。
[0032]SEQ ID NO:6_ 代表位于 KK179-2 的插入 DNA 側翼的 5，序列(SEQ ID NO:3)、所整合的DNA插入物的序列(SEQ ID NO:5)和位于KK179-2的插入DNA側翼的3’序列(SEQID NO:4)的重疊群的4885bp核苷酸序列。
[0033]SEQ ID NO:7:用于鑒定KK179-2事件的引物SQ20901的序列。使用引物SQ20901和SQ23728(SEQ ID NO:8)的組合產生81bp PCR擴增子對于事件KK179-2的存在是陽性結 果。
[0034]SEQ ID NO:8_用于鑒定KK179-2事件的引物SQ223728的序列。
[0035]SEQ ID NO:9_用于鑒定KK179-2事件的探針PB10164的序列。其為6FAM?-標記的合成寡核苷酸。
[0036]SEQ ID NO: 10-在端點TAQMAN?測定中用作內部對照的引物SQ1532的序列。
[0037]SEQ ID NO:11_在端點TAQMAN?測定中用作內部對照的引物SQ1533的序列。
[0038]SEQ ID NO: 12-在端點TAQMAN?測定中用作內部對照的VIC?-標記的合成寡核苷酸探針PB0359的序列。
[0039]詳述
[0040]下列定義和方法被提供來更好地定義本發明和在本發明的實施中指導本領域普通技術人員。除非另外指出，否則將根據相關領域普通技術人員常規使用的含義來理解術語。分子生物學中常見術語的定義也可在Rieger等，Glossary of Genetics Classicaland Molecular,第 5 版，Springer-Verlag:New York,1991 ；和 Lewin, Genes V, OxfordUniversity Press:New York, 1994 中發現。
[0041]本發明提供了轉基因苜蓿事件KK179-2。本文中所用的術語“事件”是指由于在染色體上的特定位置處將轉基因DNA插入到植物基因組中而產生的植物、種子、后代、細胞、其植物部分和DNA分子。事件KK179-2是指由于將具有在本文以SEQ ID NO:5提供的序列的轉基因DNA插入到苜蓿(Medicago sativa)基因組的特定染色體位置中而產生的植物、種子、后代、細胞、其植物部分和DNA分子。含有KK179-2的種子樣本已經在美國美國典型培養物保藏中心(ATCC)以登錄號PTA-11833保藏。[0042]如本文中所用，術語“苜蓿”是指苜蓿(Medicago sativa)并且包括可與苜蓿育種的所有植物變種，包括野生苜蓿種類。苜蓿也稱為苜蓿屬植物(medic)，具有與相關丁香的那些類似的藍色或黃色的花的苜蓿屬(Medicago)舊大陸草本的任何植物的名稱。與玉米或大豆不同，苜蓿植物是同源四倍體；因此，每個特征由存在于四個染色體(而不是兩個)的基團決定。這使基因研究復雜化也增加利用苜蓿的難度。商業的苜蓿種子常常由克隆混合物構成，所述克隆混合物可組成通過所選克隆中的隨機交互授粉、隨后一至三代單獨的開放授粉而產生的合成栽培品種。此外，苜蓿的復合栽培品種也可通過摻混兩種或更多種克隆的種子或交互授粉單獨的克隆而開發。當形成復合栽培品種時，等量的來自每個組分克隆的種子將摻混以形成初始的育種家種子儲備。
[0043]轉基因“事件”通過以下方式來產生:用異源DNA即包含所關注基因的RNA抑制的核酸構建體轉化植物細胞、再生由將轉基因盒插入植物的基因組而獲得的獨立轉化的轉基因植物群體以及選擇具有所需分子特征(例如將轉基因插入特定基因組位置中)的特定植物。包含事件的植物可以指包括插入植物的基因組中的特定位置的轉基因的原始轉化體。包含事件的植物還可指在植物的基因組中的相同特定位置處保留轉基因的原始轉化體的后代。這樣的后代可通過轉化體或其后代與另一種植物之間的有性異型雜交(outcross)來產生。這樣的其他植物可以是包含相同或不同的轉基因的轉基因植物；或可以是非轉基因植物，例如來自不同種類的非轉基因植物。甚至在與輪回親本重復回交后，來自轉化的親本的事件DNA在相同的基因組位置處存在于雜交的后代中。
[0044]包含事件KK179-2的DNA分子是指包含插入的轉基因DNA的至少一部分(以SEQID NO:5提供)和緊鄰插入DNA的側翼基因組DNA的至少一部分的DNA分子。這樣，包含事件KK179-2的DNA分子具有代表轉基因DNA插入物的至少一部分和將轉基因DNA插入其中的植物的基因組的特定區域的至少一部分的核苷酸序列。與周圍植物基因組相關的事件KK179-2中的插入DNA的排列對于事件KK179-2是特異性的和獨特的，并且因此，這樣的DNA分子的核苷酸序列是診斷性的并鑒定事件KKl79-2。這樣的DNA分子的序列的實例在本文中以 SEQ ID NO:1、SEQ I·D NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4 和 SEQ ID NO:6 提供。該DNA分子也是包含事件KK179-2的植物的染色體的完整部分并且可被傳遞至植物的后代。
[0045]如本文中所用，“重組DNA分子”為包含不能一起天然存在的DNA分子的組合并且為人干預的結果的DNA分子，例如，由至少兩個彼此異源的DNA分子的組合組成的DNA分子，和/或為人工合成的并且包含來源于通常存在于自然界中的多核苷酸序列的多核苷酸序列的DNA分子，和/或包含人工并入宿主細胞的基因組DNA的轉基因和宿主細胞基因組的相關側翼DNA的DNA分子。重組DNA分子的實例為本文中描述的由將轉基因插入至苜蓿基因組內而產生的DNA分子，其可最終導致重組RNA和/或蛋白質分子在該生物體中的抑制。核苷酸序列或由其衍生的任何片段也可被視為重組DNA分子(如果該DNA分子可從細胞或組織、或來自植物或種子或植物組織的勻漿物提取)；或者可作為擴增子由從細胞或組織、或來自植物或種子或植物組織的勻漿物提取的DNA或RNA產生，其任何一個來源于源自事件KK179-2的此類材料。就此而言，如在SEQ ID NO:USEQ ID NO:2所示的接合序列，以及來源于也含有這些接合序列的事件KK179-2的核苷酸序列被認為是重組DNA，不論這些序列存在于事件KK179-2的細胞的基因組內或以可檢測量存在于來源于事件KK179-2的組織、后代、生物樣本或商品中。如本文中所用，術語“轉基因”是指人工并入宿主細胞的基因組的多核苷酸分子。這樣的轉基因對于宿主細胞可以是異源的。術語“轉基因植物”是指包含這樣的轉基因的植物。“轉基因植物”包括其基因組已通過重組DNA的穩定整合而發生改變的植物、植物部分、植物細胞或種子。轉基因植物包括從原始轉化的植物細胞以及來自經轉化植物的后生代或雜交的后代轉基因植物再生的植物。由于這種基因組變化，轉基因植物明顯不同于相關野生型植物。轉基因植物的實例是本文描述為包含事件KK179-2的植物。
[0046]如本文中所用，術語“異源的”是指在遺傳環境(其中目前發現序列)中通常不存在于給定宿主基因組的序列。在這方面，序列可原產于宿主基因組，但是相對于宿主序列中的其他基因序列重排。
[0047]本發明提供了 DNA分子及其相應的核苷酸序列。如本文中所用，術語“DNA序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”是指通常從5’ (上游)末端至3’ (下游)末端呈現的DNA分子的核苷酸的序列。本文中使用的命名法為美國聯邦法規法典(United States Code ofFederal Regulations) § 1.822 的第 37 條標題所要求的和 WIPO Standard ST.25(1998)，附錄2中的表1和3中所示的命名法。本發明公開僅關于轉基因事件KK179-2中提供的兩條核苷酸序列鏈的一條鏈。因此，通過暗示和推導，互補序列(在本領域中也稱為完全互補序列或反向互補序列)在本發明的范圍內，并且從而也預期在所述要求保護的主題的范圍內。
[0048]對應于插入的轉基因DNA的完全核苷酸序列和位于插入的轉基因DNA的任一末端側翼的苜蓿基因組DNA的大部分區段的核苷酸序列在本文中以SEQ ID N0:6提供。該核苷酸序列的小部分為以SEQ ID NO:5提供的插入的轉基因DNA。位于插入的轉基因DNA的5’末端和插入的DNA的5’末端的一部分側翼的基因組DNA的核苷酸序列在本文中以SEQID NO:3提供。位于插入的轉基因DNA的3’末端和插入的DNA的3’末端的一部分側翼的基因組DNA的核苷酸序列在本文中以SEQ ID N0:4提供。橫跨其中轉基因DNA連接于和聯接于基因組DNA的位置的區域,在本文中稱為接合處(junction)。“接合序列(junctionsequence) ”或“接合區域(junction region) ”是指橫跨插入的轉基因DNA和相鄰側翼基因組DNA的DNA序列和/或相應DNA分子。事`件KK179-2的接合序列的實例在本文中以SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2提供。來源于苜蓿植物或種子的核苷酸分子中這些接合序列之一的鑒定確定了 DNA獲自事件KK179-2并且診斷來自事件KK179-2的DNA的存在。SEQID NO:1為橫跨基因組DNA與插入DNA的5’末端之間的接合處的20bp核苷酸序列。SEQID NO:2為橫跨基因組DNA與插入DNA的3’末端之間的接合處的20bp核苷酸序列。來源于轉基因事件KK179-2的包括SEQ ID NO:1的連續核苷酸的DNA的任何區段在本發明的范圍內。來源于轉基因事件KK179-2的包括SEQ ID NO:2的連續核苷酸的DNA的任何區段在本發明的范圍內。此外，包含與本段落內描述的任何序列互補的序列的任何多核苷酸分子在本發明的范圍內。圖1舉例說明了苜蓿事件KK179-2的基因組中的轉基因DNA插入物，和以5’至3’排列的SEQID NO:1_6的相對位置。
[0049]本發明進一步提供了可用作用于診斷來源于事件KK179-2的DNA在樣本中的存在的引物或探針的示例性DNA分子。此類引物或探針對于靶核酸序列是特異性的，并且因此對于通過本文中描述的本發明的方法鑒定事件KK179-2核酸序列是有用的。
[0050]"探針"是可檢測標記或報告分子例如放射性同位素、配體、化學發光劑或酶所連接的分離的核酸。這樣的探針與靶核酸的鏈互補，在本發明的情況下，與來自苜蓿事件KK179-2的基因組DNA的鏈互補(不管來自苜蓿植物或來自包含來自事件的DNA的樣本)。根據本發明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸而且還包括特異性結合靶DNA序列的聚酰胺和其他探針材料，并且這樣的結合的檢測可用于診斷/確定/確認該靶DNA序列在特定樣本中的存在。
[0051]"引物"通常是分離的多核苷酸，其被設計來用于特異性退火或雜交法以與互補的靶DNA鏈雜交以形成引物與靶DNA鏈之間的雜交體，然后通過聚合酶例如DNA聚合酶沿著靶DNA鏈延伸。可將引物對與模板DNA例如苜蓿基因組DNA的樣本一起用于熱擴增或等溫擴增，例如聚合酶鏈式反應(PCR)或其他核酸擴增方法，以產生擴增子，其中從這樣的反應產生的擴增子可具有對應于位于其中引物與模板雜交的兩個位點之間的模板DNA的序列的DNA序列。如本文中所用，“擴增子”為一條或一段已使用擴增技術合成的DNA，例如擴增反應的產物。在本發明的一個實施方案中，診斷事件KK179-2的擴增子包含未在苜蓿基因組中天然存在的序列。如在本發明中所用，引物對意圖是指為了線性擴增被引物對的單個成員靶向結合的位置之間的多核苷酸區段，通常在熱擴增或等溫擴增反應或其他核酸擴增方法中使用結合雙鏈核苷酸區段的相反鏈的兩個引物。用作引物的示例性DNA分子以SEQ ID NO:7-9提供，可用作第一 DNA分子和不同于第一 DNA分子的第二 DNA分子，并且兩個分子各自具有充足長度的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的連續核苷酸或其互補序列以用作DNA引物，以便當與來源于事件KK179-2的模板DNA—起用于擴增反應時，可產生對于轉基因事件KK179-2是特異性和獨特的擴增子。術語“擴增子”的使用特別排除可在DNA擴增反應中形成的引物-二聚體。
[0052]根據本發明的探針和引物可與靶序列具有完全序列同一性，雖然可通過常規方法設計與靶序列不同的保持優先與靶序列雜交的能力的引物和探針。為了核酸分子能夠用作引物或探針，僅需在序列上充分互補以能夠在所使用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩定的雙鏈結構。任何核酸雜交或擴增方法可用于鑒定來自事件KK179-2的轉基因DNA在樣本中的存在。探針和引物的長度通常為至少約11個核苷酸、至少約18個核苷酸、至少約24個核苷酸和至少約30個核苷酸或更多個核苷酸。此類探`針和引物在高度嚴格雜交條件下與靶序列特異性雜交。
[0053]用于制備和使用探針和引物的方法例如在Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第 2 版，1-3 卷,Sambrook 等編著，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, 1989 (在下文為"Sambrook 等，1989 " ) ；Current Protocols inMolecular Biology, Ausubel 等編著，Greene Publishing and ffiley-1nterscience, NewYork, 1992 (定期更新)(在下文為"Ausubel 等，1992”);和 Innis 等，PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications, Academic Press:San Diego, 1990 中描述。PCR-引物對可來源于已知序列，例如通過使用意圖用于該目的的計算機程序例如Primer (版本0.5, ? 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)。
[0054]基于本文公開的側翼DNA和插入序列的引物和探針可用于通過已知方法例如通過對此類序列進行重新克隆和測序來確認公開的序列。
[0055]本發明的核酸探針和引物在嚴格條件下與靶DNA序列雜交。任何核酸雜交或擴增方法可用于鑒定來自轉基因事件的DNA在樣本中的存在。核酸分子或其片段能夠在某些環境下與其他核酸分子特異性雜交。如本文中所用，如果兩個核酸能夠形成反向平行雙鏈核酸結構，則兩個核苷酸分子被認為能夠彼此特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示完全互補性，則一個核酸分子被認為是另一個核酸分子的“互補序列”。如本文中所用，當分子之一的每個核苷酸與另一個分子的核苷酸互補時，則分子被認為顯示“完全互補性”。如果兩個分子可以以足夠的穩定性彼此雜交以允許它們在至少“低嚴格”條件下保持彼此退火，則它們被認為是“最低程度互補”。類似地，如果分子可以以足夠的穩定性彼此雜交以允許它們在“高嚴格”條件下保持彼此退火，則它們被認為是“互補的”。嚴格條件由SambiOOk等，1989和由 Haymes 等，見:Nucleic Acid Hybridization, APractical Approach, IRL Press,Washington, DC(1985)描述。因此偏離完全互補性是可允許的，只要這樣的偏離不完全排除分子形成雙鏈結構的能力。為了核酸分子用作引物或探針，僅需要在序列上充分互補以能夠在采用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩定的雙鏈結構。
[0056]如本文中所用，基本上同源的序列是在高嚴格條件下與所比較的核酸序列的互補序列特異性雜交的核酸序列。促進DNA雜交的合適的嚴格條件，例如在約45°C下6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，接著在50°C下2.0x SSC洗滌，是本領域技術人員已知的或可在 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989),
6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可選自50°C下約2.0xSSC的低嚴格條件至50°C下約0.2x SSC的高嚴格條件。此外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫約22°C的低嚴格條件增加到約65°C的高嚴格條件。溫度和鹽均可以變化，或者溫度或鹽濃度中的任一個可以保持恒定，而另一個變量發生變化。在一個實施方案中，本發明的核酸在高嚴格條件下與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或其互補序列或片段中所示的一個或多個核酸分子特異性雜交。探針與靶DNA分子的雜交可通過本領域技術人員已知的許多方法來檢測。這些可包括但不限于突光標簽、放射性標簽、基于抗體的標簽和化學發光標簽。
[0057]關于使用特定擴增引物對擴增靶核酸序列(例如，通過PCR)，"嚴格條件"是使得引物對僅與具有相應的野生型序列(或其互補序列)的引物將結合的靶核酸序列雜交的條件，并優選在DNA擴增反應中產生獨特的擴增產物(擴增子)。DNA擴增方法的實例包括PCR、重組酶聚合·酶擴增(RPA)(參見例如美國專利號7，485，428)、鏈置換擴增(SDA)(參見例如，美國專利號5，455，166和5，470，723)、轉錄介導的擴增(TMA)(參見例如，Guatelli 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:1874-1878 (1990))、滾環擴增(RCA)(參見例如，Fire 和 Xu，Proc.Natl.Acad Sc1.USA92:4641-4645(1995) ；Lui,等，J.Am.Chem.Soc.118:1587-1594(1996) ；Lizardi 等，Nature Geneticsl9:225-232 (1998)，美國專利號5，714，320和6，235，502))、解鏈酶依賴性擴增(HDA)(參見例如Vincent等，EMBOReports5(8) =795-800(2004);美國專利號7，282，328)和多重置換擴增(MDA)(參見例如Dean 等，Proc.Natl.Acad Sc1.USA99:5261-5266 (2002))。
[0058]術語"對于(靶序列)特異性的"指示探針或引物在嚴格雜交條件下僅與包含靶序列的樣本中的靶序列雜交。
[0059]如本文中所用，術語“分離的”是指至少部分地將分子與通常以其原始或天然狀態與其聯接的其他分子分離。在一個實施方案中，術語“分離的”是指這樣的DNA分子，其至少部分地與以原始或天然狀態通常位于所述DNA分子側翼的核酸分離。因此，例如作為重組技術的結果融合于它們通常不與其聯接的調控或編碼序列的DNA分子在本文中被認為是分離的。此類分子即使當整合入宿主細胞的染色體或與其他DNA分子一起存在于核酸溶液中時亦被認為是分離的。
[0060]本領域技術人員公知的許多方法可用于分離和操作本發明中公開的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶鏈式反應)技術可用于擴增特定起始DNA分子和/或產生原始分子的變體。DNA分子或其片段還可通過其他技術例如通過利用化學方法直接合成片段(這通常通過使用自動寡核苷酸合成儀來實施)來獲得。
[0061]因此，本文中提供的DNA分子和相應核苷酸序列可用于(除其他用途之外)鑒定事件KK179-2，選擇包含事件KK179-2的植物品種或雜交體，檢測來源于事件KK179-2的DNA在樣本中的存在，和監測樣本的事件KK179-2的存在和/或不存在或包含事件KK179-2的植物和植物部分。
[0062]本發明提供了植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織、和葉)。這些植物、后代、種子、植物細胞、植物部分和商品包含可檢測量的本發明的多核苷酸，即例如包含以SEQ ID NO:1的連續核苷酸和SEQ ID NO:2的連續核苷酸提供的序列中的至少一個的多核苷酸。本發明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分和商品還可含有一個或多個另外的抑制靶。
[0063]本發明提供了來源于包含事件KK179-2的轉基因植物的植物、后代、種子、植物細胞和植物部分例如花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織以及葉。為了使得能夠進行本發明，已按照布達佩斯條約(Budapest Treaty)保藏了包含事件KK179-2的種子的代表性樣本。經選擇用于接收保藏物的貯藏處為美國美國典型培養物保藏中心(ATCC)，地址為10801UniversityBoulevard, Manassas, Virginia USA,由B政編石馬 20110。ATCC Ρ&藏處已對事件ΚΚ179-2種子指定了登錄號PTA-11833。
[0064]本發明提供了包含具有選自SEQ ID NO:1的連續核苷酸、SEQID NO:2的連續核苷酸的核苷酸序列的DNA分子的微生物。這樣的微生物的實例為轉基因植物細胞。微生物例如本發明的植物細胞在許多工 業應用中是有用的，所述工業應用包括但不限于:(i)用作用于科學調查或工業研究的研究工具；(ii)用在用于產生可用于隨后的科學研究或用作工業產品的內源或重組碳水化合物、脂質、核酸、酶或蛋白質產物或小分子的培養物中；和
(iii)與現代植物組織培養技術一起使用以產生隨后可用于農業研究或生產的轉基因植物或植物組織培養物。微生物例如轉基因植物細胞的產生和使用利用現代微生物學技術和人干預來產生人造的獨特的微生物。在該方法中，將重組DNA插入植物細胞的基因組以產生與天然存在的植物細胞分離且獨特的轉基因植物細胞。該轉基因植物細胞可隨后使用現代微生物技術進行培養(與細菌和酵母細胞非常相似)，并且可以以未分化的單細胞狀態存在。新型植物細胞的遺傳組成和表型為通過將異源DNA整合入細胞的基因組而產生的技術作用。本發明的另一個方面為使用本發明的微生物的方法。使用本發明的微生物例如轉基因植物細胞的方法包括(i)通過將重組DNA整合入細胞的基因組，并且然后使用該細胞衍生具有相同異源DNA的另外的細胞來產生轉基因細胞的方法；(ii)使用現代微生物技術培養含有重組DNA的細胞的方法；(iii)從培養細胞產生并且純化內源或重組碳水化合物、月旨質、核酸、酶或蛋白質產物的方法；和(iv)使用現代植組織培養技術利用轉基因植物細胞產生轉基因植物或轉基因植物組織培養物的方法。
[0065]如本文中所用，“后代”包括包含來源于具有以SEQ ID NO:1的連續核苷酸或SEQID NO:2的連續核苷酸提供的序列中的至少一個的祖先植物和/或多核苷酸的事件DNA的任何植物、種子、植物細胞和/或可再生植物部分。植物、后代和種子對于轉基因序列的存在可以是雜合的。后代可從由包含事件KK179-2的植物產生的種子和/或從由利用包含事件KK179-2的植物的花粉授精的植物產生的種子生長而來。
[0066]可對后代植物異型雜交，例如用另一種植物育種，以產生品種或雜種種子或植物。另一種植物可以為轉基因或非轉基因的。本發明的品種或雜種種子或植物因此可通過如下方式來衍生:將不存在事件KK179-2的特異性和獨特的DNA的第一親本與包含事件KK179-2的第二親本雜交，從而產生包含事件KK179-2的特異性和獨特的DNA的雜種。每一個親本可以為雜種或近親育種(inbred)/品種，只要雜交或育種產生本發明的植物或種子，例如具有包含事件KK179-2的特異性和獨特的DNA和/或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的連續核苷酸。還預期與親本植物的回交和與非轉基因植物的異型雜交，同樣地涉及營養繁殖。通常用于不同性狀和作物的其他育種方法的描述可見于幾篇參考文獻之一，例如，Fehr,見 Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J.編著，AmericanSociety of Agronomy, Madison WI (1987)中。
[0067]可以通過人類干預來完成或促成一種植物與另一種植物有性雜交，例如異花授粉(cross-pollinating),例如:通過人手工收集一種植物的花粉和將該花粉與第二種植物的花柱或柱頭接觸；通過人手和/或行動除去、破壞或覆蓋植物的雄蕊或花藥(例如，通過人工干預或通過施用化學殺配子劑)以便防止自然的自花受粉并且使得必將發生異花受粉以使受精發生；通過在進行“定向受粉”的位置人工放置傳粉昆蟲(例如，通過在果園或田間設置蜂房或通過將植物和傳粉昆蟲籠養)；通過人為開放或去除花的部分以允許外來花粉在花柱或柱頭上安置或接觸；通過選擇性放置植物(例如，有意地將植物種植于傳粉鄰近區)；和/或通過施用化學藥品以促使開花或培養(柱頭對花粉)的感受性。
[0068]在實施本方法中，可通過人工干預來完成或促成一種植物與其自身有性雜交例如自花受粉或自交的步驟，例如·:通過人手工收集植物的花粉和將該花粉與相同植物的花柱或柱頭接觸，和然后任選地阻止植物的進一步受精；通過人手和/或行動除去、破壞或覆蓋其他附近植物的雄蕊或花藥(例如，通過去雄或通過施用化學殺配子劑)以便防止天然異花受粉并且使得必將發生自花受粉以使受精發生；通過在進行“定向受粉”的位置人工放置傳粉昆蟲(例如，通過與傳粉昆蟲籠養單獨的植物)；通過人工操作花或其部分以允許自花受粉；通過選擇性放置植物(例如，有意地在傳粉鄰近區之外種植植物)；和/或通過施用化學藥品以促使開花或培養(柱頭對花粉)的感受性。
[0069]本發明提供了來源于包含事件KK179-2的植物的植物部分。如本文中所用，“植物部分”是指由從包含事件KK179-2的植物衍生的材料組成的植物的任何部分。植物部分包括但不限于細胞、花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織、纖維及葉。植物部分可以是活的、不能存活的、可再生的和/或非可再生的。
[0070]本發明提供了從包含事件KK179-2的植物衍生的商品。如本文中所用，“商品”是指由從包含事件KK179-2的植物、種子、植物細胞或植物部分衍生的材料組成的任何組合物或產品。商品可售予消費者并且可以是活的或不能存活的。不能存活的商品包括但不限于不能存活的種子和谷物；經加工的種子、種子部分和植物部分；脫水的植物組織、冷凍的植物組織和經加工的植物組織；經加工用于陸生和/或水生動物消費的動物飼料的種子和植物部分、油、粗粉、面粉、薄片、麩皮、纖維和用于人消費的任何其他食品；和生物質及燃料產品。經加工的苜蓿是世界上豆類作物飼料的最大來源。因此包含事件KK179-2的植物可用于制造通常從苜蓿植物獲得的任何商品。來源于包含事件KK179-2的植物的任何此類商品可含有至少可檢測量的對應于事件KK179-2的特異性和獨特的DNA，并且特別地可含有可檢測量的具有SEQ ID NO:1的連續核苷酸和SEQ ID NO:2的連續核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸。可使用檢測多核苷酸分子的任何標準方法，包括本文中公開的檢測方法。如果在商品中存在任何可檢測量的SEQ ID NO:1的連續核苷酸或SEQ ID NO:2的連續核苷酸，那么商品在本發明的范圍內。
[0071]因此本發明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織及葉)以及商品尤其對于生長植物以產生用于農業目的的包含事件KK179-2的種子和/或植物部分、產生用于植物育種和研究目的的包含事件KK179-2的后代是有用的，可與用于工業和研究應用的微生物學技術一起使用和售予消費者。
[0072]本發明提供了用于產生具有減少的木質素的植物和包含事件KK179-2的植物的方法。事件KK179-2植物通過與美國專利5，914，451中所述的方法類似的土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化方法,使用用構建體pFG118近親育種的苜猜系來產生。構建體pFG118含有用于在苜蓿植物細胞中下調CCOMT酶的植物抑制盒。將轉基因苜蓿細胞再生到完整苜蓿植物中并且個別植物選自顯示所需分子特征(例如轉基因盒的完整性、構建體主鏈序列的缺失和解鏈的卡那霉素抗性選擇盒的損失)的獨立轉化的轉基因植物群體。而且，進行反向PCR和DNA序列分析以確定5’和3’插入物至植物基因組接合處，以確認元件在插入物內的組織(圖1)，以及確定插入物在苜蓿事件KK179-2中的全DNA序列(SEQID NO:5) ο此外，在田地條件下針對減少的木質素篩選并選擇轉基因植物。其基因組中含有pFG118的抑制盒的苜蓿植物為本發明的方面。
[0073]提供了用于產生包含轉基因事件KK179-2的具有減少的木質素的植物的方法。這些方法中使用的轉基因植物對于轉基因可以是雜合的。通過這些方法產生的后代植物可以是品種或雜種植物；可從由植物產生的種子和/或從由利用包含事件KK179-2的植物的花粉授精的植物產生的包含事件KK179-2的種子生長而來；以及對于轉基因可以是純合的或雜合的。隨后可將后代植物自花受粉以產生`植物的純育種系，例如對于轉基因是純合的植物，或可選擇地將后代植物異型雜交，例如與另一種無關植物育種以產生品種或雜種種子或植物。如本文中所用，術語“接合性”是指植物中DNA在特定染色體位置(基因座)處的相似性。在本發明中，DNA特異性是指連同接合序列(事件DNA) —起的轉基因插入物。如果具有接合序列的轉基因插入物存在于染色體對的每條染色體(4個等位基因)上的相同位置處，那么植物是純合的。如果具有接合序列的轉基因插入物存在于染色體對的僅一條染色體(I個等位基因)上，那么植物被認為是雜合的。野生型植物對于事件DNA是無效的(null)。
[0074]由這些方法涵蓋的和通過使用這些方法產生的后代植物和種子與其他植物截然不同，例如因為所述后代植物和種子是重組的并且通過人工干預產生；含有至少一個由本發明的轉基因DNA組成的等位基因；和/或含有可檢測量的選自SEQ ID NO:1的連續核苷酸或SEQID NO:2的連續核苷酸的多核苷酸序列。種子可選自單株后代植物，并且只要種子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，其就可在本發明的范圍內。[0075]可評估本發明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織及葉)和商品的DNA組成、基因表達和/或蛋白質表達。這樣的評估可通過使用各種方法例如PCR、測序、northern印跡、southern分析、western印跡、免疫沉淀和ELISA或通過使用本文中提供的檢測方法和/或檢測試劑盒來進行。
[0076]提供了檢測對于事件KK179-2是特異性的組合物在樣本中的存在的方法。一種方法由檢測對于包含事件KK179-2的細胞、組織、種子、植物或植物部分是特異性的DNA以及來源于所述細胞、組織、種子、植物或植物部分的DNA的存在組成。該方法提供了待與引物對接觸的模板DNA樣本，所述引物對能夠在經歷適合于擴增的條件后從事件KK179-2DNA產生擴增子，特別是包含SEQ ID NO:1和/或SEQID NO:2或其互補序列的擴增子。擴增子從來源于事件KK179-2的模板DNA分子產生，只要模板DNA分子結合SEQ ID NO:1或SEQIDNO:2的特異性和獨特的核苷酸序列。擴增子可以為單鏈或雙鏈DNA或RNA，這取決于被選擇用于產生擴增子的聚合酶。該方法提供了檢測在任何這樣的擴增反應中產生的擴增子分子，和確認對應于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互補序列的核苷酸在擴增子的序列中的存在。擴增子中對應于SEQ ID N0:1和/或SEQ IDNO:2或其互補序列的核苷酸的檢測確定和/或診斷事件KK179-2特異性DNA和從而包含事件KK179-2的生物材料在樣本中的存在。
[0077]提供了用于檢測對應于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的DNA分子在由來源于植物或植物組織的材料組成的樣本中的存在的另一種方法。該方法由如下步驟組成:(i)從植物或從一組不同的植物獲得DNA樣本，(ii)將DNA樣本與包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2中所示的核苷酸的DNA探針分子接觸，(iii)允許探針和DNA樣本在嚴格雜交條件下雜交，和然后(iv)檢測探針與靶DNA樣本之間的雜交事件。雜交組合物的檢測診斷SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4(視具體情況而定)在DNA樣本中的存在。雜交的不存在可選擇地診斷轉基因事件在樣本中的不存在，如果適當的陽性對照同時進行測試的話。或者，確定特定植物包含對應于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列或其互補序列之任一或兩者確定植物含有至少一個對應于事件KK179-2的等位基因。
[0078]因此可能通過任何 公知的核酸擴增和檢測方法例如聚合酶鏈式反應(PCR)、重組酶聚合酶擴增(RPA)或使用核酸探針的DNA雜交檢測本發明的核酸分子的存在。事件特異性 PCR 測定例如由 Taverniers 等(J.Agric.Food Chem.,53:3041-3052,2005)進行了論述，其中顯示了轉基因玉米品系Btll、Btl76和GA21以及轉基因事件RT73的事件特異性跟蹤系統。在本研究中，基于每一個事件的基因組/轉基因接合處的序列設計事件特異性引物和探針。轉基因植物事件特異性DNA檢測方法已在美國專利號7，632，985 ;7，566，817 ；7，368，241 ;7，306，909 ;7，718，373 ;7，189，514,7, 807，357 和 7，820，392 中描述。
[0079]提供了 DNA檢測試劑盒。一種類型的試劑盒含有至少一種具有足夠長度的SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的連續核苷酸的DNA分子以用作對于檢測來源于轉基因事件KK179-2的DNA在樣本中的存在是特異性的DNA引物或探針。利用試劑盒檢測的DNA分子包含SEQ ID NO:1所示的序列的連續核苷酸。或者，試劑盒可含有至少一種具有足夠長度的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的連續核苷酸的DNA分子以用作對于檢測來源于轉基因事件KK179-2的DNA在樣本中的存在是特異性的DNA引物或探針。利用試劑盒檢測的DNA分子包含SEQ ID NO:2所示的連續核苷酸。[0080]備選試劑盒使用這樣的方法，其中將靶DNA樣本與上述引物對接觸，然后進行足以產生包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的連續核苷酸的擴增子的核酸擴增反應。擴增子的檢測和確定SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的連續核苷酸或其互補序列在擴增子的序列中的存在診斷事件KK179-2特異性DNA在DNA樣本的存在。
[0081]提供了足以用作DNA探針的DNA分子，其對于測定、檢測或對于診斷對于事件KK179-2DNA是特異性和獨特的DNA在樣本中的存在或甚至不存在是有用的。DNA分子含有SEQ ID NO:1的連續核苷酸或其互補序列和SEQ ID NO:2的連續核苷酸或其互補序列。
[0082]可利用本領域已知的多種核酸擴增方法(包括熱擴增和等溫擴增方法)的任一方法實現核酸擴增。可通過使用來源于本文中提供的序列的引物，然后進行擴增子或克隆的DNA的標準DNA測序來驗證來自事件KK179-2 (包含事件KK179-2的代表性種子樣本以ATCCPTA-11833保藏)的異源DNA插入物、接合序列或側翼序列。
[0083]可通過多種技術檢測由這些方法產生的擴增子。一種這樣的方法為遺傳位點分析(Genetic Bit Analysis) (Nikiforov 等 Nucleic Acid Res.22:4167-4175,1994),其中設計了與相鄰的側翼基因組DNA序列和插入DNA序列重疊的DNA寡核苷酸。將寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在熱擴增目標區域(使用插入的序列中的一個引物和相鄰側翼基因組序列中的一個引物)后，單鏈擴增子可與固定的寡核苷酸雜交，并將其用作模板以使用DNA聚合酶和對于預期的下一個堿基是特異性的標記的ddNTP進行單堿基延伸反應。讀數可以是基于熒光或ELISA的。歸因于成功的擴增、雜交和單堿基延伸，熒光或其他信號的檢測指示插入物/側翼序列的存在。
[0084]另一個方法為由Winge (Innov.Pharma.Tech.00: 18-24, 2000)描述的焦憐酸測序技術。在該方法中，設計與相鄰基因組DNA和插入DNA接合處重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸與來自目標區域的單鏈擴增子雜交(一個引物在插入的序列中以及一個引物在側翼基因組序列中)，并且在DNA聚合·酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和螢光素的存在下進行孵育。單獨地添加ddNTP，并且摻入導致被測量的光信號。歸因于成功的擴增、雜交和單或多堿基延伸，光信號指示轉基因插入物/側翼序列的存在。
[0085]由Chen等，(Genome Res.9:492-498,1999)描述的突光偏振為可用于檢測擴增子的方法。通過使用該方法，設計與基因組側翼序列和插入DNA接合處重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸與來自目標區域的單鏈擴增子雜交(一個引物在插入DNA中并且一個引物在側翼基因組DNA序列中)，并且在DNA聚合酶和熒光標記的ddNTP的存在下進行孵育。單堿基延伸導致ddNTP的并入。并入可使用熒光計測量為偏振的改變。歸因于成功的擴增、雜交和單堿基延伸，偏振的改變指示轉基因插入物/側翼序列的存在。
[0086]使用由制造商提供的說明書，TAQMAN?(PE Applied Biosystems, FosterCity, CA)也可用于檢測和/或定量DNA序列的存在。簡而言之，設計與基因組側翼序列和插入DNA接合處重疊的FRET寡核苷酸探針。在耐熱聚合酶和dNTP的存在下，循環FRET探針和擴增引物(一個引物在插入DNA序列中并且一個引物在側翼基因組序列中)。FRET探針的雜交導致熒光部分的切割和釋放，與FRET探針上的猝滅部分分離。歸因于成功擴增和雜交，熒光信號指示側翼/轉基因插入序列的存在。
[0087]已描述了分子信標用于序列檢測，如Tyangi等(Nature Biotech.14:303-308,1996)中所描述的。簡而言之，設計與側翼基因組序列和插入DNA接合處重疊的FRET寡核苷酸探針。RRET探針的獨特結構導致其包含使熒光與猝滅部分保持緊密靠近的二級結構。在耐熱聚合酶和dNTP的存在下循環FRET探針和擴增引物(一個引物在插入DNA序列中并且一個引物在側翼基因組序列中)。在成功的擴增后，FRET探針與靶序列的雜交導致探針二級結構的消除以及熒光部分與猝滅部分的空間分離，從而導致熒光信號的產生。歸因于成功的擴增和雜交，熒光信號指示側翼/轉基因插入序列的存在。
[0088]其他描述的方法例如微流體學(microfIuidics)(美國專利公布號2006068398、美國專利號6，544，734)提供了分離和擴增DNA樣本的方法和裝置。光學染料用于檢測和測量特異性DNA分子(W0/05017181)。包括用于檢測結合特異性DNA分子并且隨后可被檢測的DNA分子或納米珠粒的電子傳感器的納米管裝置(W0/06024023)。
[0089]可使用本文中公開的組合物和DNA檢測領域內公知的方法來開發DNA檢測試劑盒。試劑盒用于鑒定樣本中的事件KK179-2并且可被應用于用于培育包含適當的事件DNA的植物的方法。試劑盒可含有與SEQ ID NO:1-6或其片段或互補序列相似或互補的DNA引物或探針。
[0090]本發明的試劑盒和檢測方法因而可用于(除其他用途之外)鑒定事件KK179-2，選擇包含事件KK179-2的植物品種或雜交體，檢測來源于事件KK179-2的DNA在樣本中的存在，和監測樣本的事件KK179-2的存在或不存在或包含事件KK179-2的植物、植物部分或商
品O
[0091]包括下列實施例來舉例說明本發明的某些實施方案的實例。本領域技術人員應當理解，下列實施例中公開的技術代表本發明人已發現非常適合于本發明的實施，并從而被認為構成用于其實施的優選模式的實例。然而，鑒于本公開內容，本領域技術人員應當理解可在不背離本發明的精神和范圍的情況下在公開的特定實施方案中進行許多改變，并且獲得類似或相似的結果。`實施例
[0092]實施例1:使用反向PCR分離側翼序列以及通過測序鑒定側翼序列
[0093]該實施例描述了針對事件KK179-2使用反向PCR分離位于轉基因DNA插入物側翼的苜蓿基因組DNA序列，以及通過測序鑒定側翼基因組序列。
[0094]在事件KKl79-2中位于T-DNA插入側翼的序列使用反向PCR確定，如在Ochman等，1990(PCR Protocols:A guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.)中描述。植物基因組DNA從來自在溫室條件下生長的組織的野生型R2336和轉基因系分離。冰凍的葉組織用研缽和研杵在液氮中磨碎或通過機械研磨進行磨碎，隨后使用本領域已知的方法進行DNA提取。該方法可由本領域技術人員改進以從任何組織(包括但不限于種子)提取DNA。
[0095]用基于轉基因DNA的限制分析選擇的限制內切核酸酶消化來自每個樣本的DNA的等份試樣。限制片段的自連接后，使用從轉基因序列設計的引物進行PCR擴增，所述引物將擴增從轉基因DNA的5’和3’末端延伸的序列。可使用多種Taq聚合酶和擴增系統。表2顯不使用Phusion高保真DNA聚合酶(目錄號F531S或F531L, New England Biolabs)和Thermalcyclers Applied Biosystems GeneAmp9700, ABI9800Fast Thermal Cycler 與 MJOpticon進行側翼序列分離的PCR擴增的實例。[0096]表1.用于側翼序列分離的反向PCR擴增的實例
【權利要求】
1.一種命名為KK179-2的苜蓿植物種子，其具有以專利保藏號PTA-11833保藏于美國典型培養物保藏中心(ATCC)的代表性種子。
2.一種苜蓿植物KK179-2或其部分，其通過使權利要求1所述的種子生長而產生。
3.如權利要求2所述的苜蓿植物KK179-2或其部分，其包含花粉、胚珠、花、芽、根或葉。
4.如權利要求2所述的苜蓿植物KK179-2的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含苜蓿事件KK179-2。
5.如權利要求4所述的后代植物或其部分，進一步包含花粉、胚珠、花、芽、根或葉。
6.如權利要求4所述的苜蓿植物KK179-2或種子或其部分，其基因組產生包含選自SEQID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 的 DNA 分子的擴增子。
7.一種重組DNA分子，其包含 a.選自SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的多核苷酸分子； b.與SEQID NO:6具有至少90%同一性的多核苷酸分子；或 c.與a)或b)互補的多核苷酸分子。
8.如權利要求7所述的DNA分子，其中所述DNA分子來源于事件KK179-2，已于ATCC登錄號PTA-11833下保藏的種子的代表性樣本。
9.如權利要求7所述的DNA 分子，其中所述DNA分子是由來源于事件KK179-2的DNA的模板分子產生的擴增子。
10.一種診斷事件KK179-2DNA的存在的多核苷酸探針，其中所述多核苷酸探針具有充分長度以結合包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2或其互補序列的核酸分子，并且其中所述多核苷酸探針在嚴格雜交條件下與包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互補序列的DNA分子雜交，并且在嚴格雜交條件下不與不包含SEQ ID NO:USEQ ID NO:2或其互補序列的DNA分子雜交。
11.一種檢測來源于事件KK179-2的DNA分子在DNA樣本中的存在的方法，所述方法包括: a.將所述DNA樣本與根據權利要求6所述的多核苷酸探針接觸: b.將所述DNA樣本和所述多核苷酸探針經歷嚴格雜交條件；和 c.檢測所述多核苷酸探針對所述DNA樣本中的來源于事件KK179-2的所述DNA分子的雜父。
12.—種DNA分子對，其由第一 DNA分子和與所述第一 DNA分子不同的第二 DNA分子組成，其中所述第一和第二 DNA分子包含具有SEQ ID NO:6的足夠長度的連續核苷酸的核苷酸序列或其互補序列的多核苷酸分子，以用作當與來源于事件KK179-2的模板一起用于擴增反應時產生診斷樣本中的事件KK179-2DNA的擴增子的DNA引物。
13.一種DNA檢測試劑盒，其包含SEQ ID NO:6的足夠長度的連續核苷酸或其互補序列的至少一種多核苷酸分子，以用作對檢測來源于事件KK179-2的DNA的存在特異的DNA引物或多核苷酸探針，其中所述DNA的檢測診斷所述KK179-2DNA在樣本中的存在。
14.如權利要求13所述的DNA檢測試劑盒，其中至少一種多核苷酸分子選自SEQIDNO:1 和 SEQ ID NO:2。
15.一種微生物，其包含如權利要求7所述的DNA分子。
16.如權利要求15所述的微生物，其中所述微生物為植物細胞。
【文檔編號】A01H5/12GK103857798SQ201280032382
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年6月28日 優先權日:2011年6月30日
【發明者】C·利弗林, D·惠倫, S·坦普爾, M·麥卡斯林, M·S·雷迪, W·希亞特, W·伯恩斯, R·E·塞爾尼 申請人:孟山都技術公司, 福拉格遺傳國際有限公司