專利名稱：培育高含硫氨基酸的轉基因苜蓿的方法及其專用材料的制作方法
技術領域：
本發明涉及培育高含硫氨基酸的轉基因苜蓿的方法及其專用材料。
背景技術：
苜蓿是苜蓿屬(Medicago)植物的通稱，是一種多年生開花植物，其中最著名的是作為牧草的紫花苜蓿(Medicago sativa L.)。紫花苜蓿是苜蓿屬中很重要的多年生野生豆科牧草，主要分布在中國、蒙古、俄羅斯、巴基斯坦、印度、土耳其等國家。我國的紫花苜蓿品種資源豐富，主要分布在我國的東北、華北、西北地區。與其它種比較，紫花苜蓿具有抗逆性強、耐寒、耐旱、耐瘠薄和壽命長等突出特點，適宜在干旱、寒冷的地區種植，是我國北方建設高產優質人工草地的首選。紫花苜蓿為優質豆科牧草，開花期含粗蛋白22.75%、粗脂肪
1.78%、粗纖維22.84%。雖然紫花苜蓿的蛋白含量較高，但是其蛋白質中含硫氨基酸的含量較低。實驗證明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛產量22%以上，增產的幅度在22% 104%,同時還可增加牲畜的重量。創制高含硫氨基酸的苜蓿品種將促進畜牧業的發展。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種培育氨基酸含量改變的轉基因苜蓿的方法及其專用材料。本發明所提供的培育氨基酸含量改變的轉基因苜蓿的方法，包括向受體苜蓿中導入天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因，得到氨基酸含量改變的轉基因苜蓿；所述轉基因苜蓿具 有下述I) -4)中的全部特性或至少一種特性:I)所述轉基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，甲硫氨酸含量提高；2)所述轉基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，半胱氨酸含量提高；3)所述轉基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，天冬氨酸含量提高；4)所述轉基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，賴氨酸含量提高；所述天冬氨酸激酶是如下a)或b)的蛋白質:a)氨基酸序列如SEQ ID N0.2第65-512位所示的蛋白質；b)將SEQ ID N0.2第65-512位經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有天冬氨酸激酶活性的由a)衍生的蛋白質；所述腺苷硫酸還原酶是如下c)或d)的蛋白質:c)氨基酸序列如SEQ ID N0.4第65-330位所示的蛋白質；d)將SEQ ID N0.4第65-330位經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有腺苷硫酸還原酶活性的由c)衍生的蛋白質。其中，SEQ ID N0.2由512個氨基酸殘基組成，為葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-AK的氨基酸序列，SEQ ID N0.2的第1_62位為葉綠體引導肽TP的氨基酸序列，SEQ ID N0.2的第65-512位為天冬氨酸激酶AK的氨基酸序列。SEQ ID N0.4由330個氨基酸殘基組成，為葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR的氨基酸序列，SEQ ID N0.4的第1-62位為葉綠體引導肽TP的氨基酸序列，SEQ ID N0.4的第65-330位為腺苷硫酸還原酶APR的氨基酸序列。上述方法中，所述氨基酸含量是指葉片中的氨基酸含量。所述轉基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，總氨基酸含量沒有差異。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因可為如下I)或2)或3)或4)所示的基因，和/或所述腺苷硫酸還原酶為如下5)或6)或7)或8)所示的基因:I)編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子；2)其編碼序列是SEQ ID N0.1的第1196-2542位核苷酸的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子；4)與I)限 定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子;5)編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子；6)其編碼序列是SEQ ID N0.3的第1196-1996位核苷酸的DNA分子；7)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子;8)與I)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子。其中，SEQ ID N0.1由3132個核苷酸組成，為天冬氨酸激酶編碼基因表達盒的核苷酸序列，第1-1003位為35S啟動子序列，第1004-1189位為葉綠體引導肽基因序列，第1196-2542位為天冬氨酸激酶AK基因序列，第1004-2542位為葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合蛋白TP-AK的基因序列，第2543-3132位為ocs終止子序列。SEQ ID N0.3由2586個核苷酸組成，為腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒的核苷酸序列，第1-1003位為35S啟動子序列，第1004-1189位為葉綠體弓I導肽基因序列，第1196-1996位為腺苷硫酸還原酶APR基因序列，第1004-1996位為葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR的基因序列，第1997-2586位為ocs終止子序列。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因通過天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達載體導入所述受體苜蓿；所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達載體含有天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒；所述天冬氨酸激酶編碼基因表達盒包括啟動子I和由所述啟動子I啟動的葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因和終止所述葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因轉錄的終止子I;所述葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因是所述天冬氨酸激酶編碼基因與所述葉綠體引導肽基因相連接形成的融合基因，所述葉綠體引導肽基因位于所述天冬氨酸激酶編碼基因的上游；所述腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒包括啟動子2和由所述啟動子2啟動的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合基因和終止所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白基因轉錄的終止子2 ;所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白基因是所述腺苷硫酸還原酶編碼基因與所述葉綠體引導肽基因相連接形成的融合基因，所述葉綠體引導肽基因位于所述腺苷硫酸還原酶編碼基因的上游。
上述方法中，所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白可為TP-AK，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白可為TP-APR，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。上述方法中，所述葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合基因序列如SEQ ID N0.1的第1004-2542位所示；所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合基因序列如SEQ ID N0.3的第1004-1996 位所示。上述方法中，所述葉綠體引導肽基因的核苷酸序列可如SEQ ID N0.1的第1004-1189位所示；所述啟動子I和啟動子2均是35s(核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第1-1003位)，所述終止子I和所述終止子2均是ocs (核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第2543-3132 位)。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因表達盒的核苷酸序列具體如SEQ IDN0.1所示；腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒的核苷酸序列具體如SEQ ID N0.3所示。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達載體具體可為在PCAMBIA2300的多克隆位點插入所述天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒得到的重組表達載體PCAMBIAK-APR。上述方法中，所述受體苜蓿具體可為紫花苜蓿，如保定苜蓿。上述方法中，所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達載體可通過使用Ti質粒，植物病毒栽體，直接DNA轉化，微注射，電穿孔等常規生物技術方法導入植物細胞(Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII, AcademyPress, New York, pp.411-463;Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology(2ndEdition)。所述方法還包括從導入所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因的植株中篩選表達所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因的植株，得到所述氨基酸含量改變的轉基因苜蓿的步驟。所述轉基因苜蓿理解為不僅包含將所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因轉化受體苜蓿得到的第一代轉基因苜蓿，也包括其子代。對于轉基因苜蓿，可以在該物種中繁殖所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因，也可用常規育種技術將所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業品種中。所述轉基因苜蓿包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。下述任一種生物材料也屬于本發明的保護范圍:A、在pDES200的1xp位點插入SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒得到的重組表達載體；B、含有SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒的表達載體；C、SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒；D、SEQ ID N0.2所示的融合蛋白的編碼基因和SEQ ID N0.4所示的融合蛋白的編碼基因；E、SEQ ID N0.1的 第1004-2542位所示的葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合基因；SEQ ID N0.3的第1004-1996位所示的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合基因。本發明還要求保護SEQ ID N0.2所示的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白和SEQ ID N0.4所示的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白。實驗證明，本發明培育的氨基酸含量改變的轉基因苜蓿的甲硫氨酸含量顯著高于受體苜蓿——未轉化保定苜蓿(野生型)，是野生型的1.5倍；轉pCAMBIAK-APR株系的半胱氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.2倍，轉pCAMBIAK-APR株系的天冬氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.4倍；RpCAMBIAK-APR株系的賴氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.5倍。
圖1為共表達載體pCAMBIAK-APR的物理圖譜。圖2為共表達載體pCAMBIAK-APR酶切鑒定圖。圖中，I是 AscI 內切酶，2 是 1-scel 內切酶，M 為 Ikb DNA ladder (Fermentas),由下到上分別為 2500bp, 3000bp, 3500bp, 4000bp, 5000bp, 6000bp, 8000bp, IOOOObp 圖3為轉基因植株的PCR檢測圖，WT為野生型植株(陰性對照)，1-6為轉pCAMBIAK-APR苜蓿的PCR產物，7為未加樣品PCR產物(空白對照)，8為質粒 pCAMBIAK-APR 的 PCR 產物(陽性對照)，M 為 GeneRuler TMlkb DNA ladder (MBIFermentas, Maryland, USA)。圖4為轉基因植株的RT-PCR檢測圖，WT為野生型植株(陰性對照)，1_8為轉pCAMBIAK-APR苜蓿的RT-PCR產物，Actin是內參基因。
具體實施例方式
以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的生物材料如下:大腸桿菌K12(趙倩等.大腸桿菌天冬氨酸激酶IysC基因的克隆及定點突變.農業生物技術學報.1999，7 (4))，公眾可從商業途徑獲得，也可從中國農業大學獲得，以重復本申請實驗。pOSBlO8、pOSB2。8、pDES200、大腸桿菌 SW106 (Lei Ma, Jiangli Dong, YongshengJin，Mingliang Chen, Xiaoye Shenj Tao Wang.RMDAP:A Versatile, Ready-To-Use Toolboxfor Multigene Genetic Transformation.PLoS ONE|www.plosone.0rg.May2011.Volume6.1ssue5.el9883)，公眾可從中國農業大學獲得，以重復本申請實驗。銅綠假單抱桿菌(GeorgeTsakraklideslet al.Sulfate reduction isincreased in transgenic Arabidopsis thaliana expressing50-adenylyIsulfatereductase from Pseudomonas aeruginosa.The Plant Journal (2002) 32，879 - 889)，公眾可從商業途徑獲得，也可從中國農業大學獲得，以重復本申請實驗。根癌農桿菌EHA105記載在下述文獻中:抗生素抑制農桿菌的效果及對條斑紫菜生長發育的影響，王萍等，水產科學，2009，28 (7)，公眾可從中國農業大學獲得，以重復本申請實驗。保定苜蓿(張萬軍王濤.紫花苜蓿愈傷成苗高頻再生體系的建立及其影響因子的研究.中國農業科學2002，35 (12):1579-1583)，公眾可從商業途徑獲得，也可從中國農業大學獲得，以重復本申請實驗。實施例1、利用天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因培育氨基酸含量改變的轉基因苜蓿一、構建天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達載體pCAMBIAK-APR1、構建含有天冬氨酸激酶編碼基因表達盒的中間載體p0SB108-AK用正向引物為5’ -CTCGAGTCTGAAATTGTTGTCTCCAA-3’和反向引物 5’ -TCTAGATTACTCAAACAAATTACTAT-3’，正向引物自5，端第I到6位是XhoI酶切位點，反向引物從5，端起第1-6位是XbaI酶切位點，從大腸桿菌K12中擴增出天冬氨酸激酶編碼基因(AK基因)，回收PCR擴增產物。對PCR擴增產物進行測序。測序結果為，該PCR產物中的AK基因的編碼序列是SEQ ID N0.1的第1196-2542位，編碼SEQ ID N0.2的第65-512位所示的天冬氨酸激酶AK。將AK基因的PCR產物用XhoI和XbaI雙酶切后插入載體p0SB108的XhoI和XbaI位點，得到載體P0SB108-AK。p0SB108-AK中含有天冬氨酸激酶編碼基因表達盒，該天冬氨酸激酶編碼基因表達盒的核苷酸序列是SEQ ID N0.1。SEQ ID N0.1由3132個核苷酸組成，為天冬氨酸激酶編碼基因表達盒的核苷酸序列，第1-1003位為35S啟動子序列，第1004-1189位為葉綠體引導肽基因序列，第1196-2542位為天冬氨酸激酶AK基因序列，第1004-2542位為葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合蛋白TP-AK的基因序列，第2543-3132位為ocs終止子序列。SEQ ID N0.1的第1004-2542位所示的葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合蛋白TP-AK的基因編碼SEQ ID N0.2所示的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-AK。SEQ ID N0.2的第1-62位為葉綠體引導肽TP的氨基酸序列，SEQ ID N0.2的第65-512位為天冬氨酸激酶AK的氨基酸序列。2、構建含有腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒的中間載體p0SB208-APR用正向引物為5’ -CCGCTCGAGCTGCCCTTTGCTACCATTCC-3’和反向引物 5’ -GCTCTAGATCAGGCCTTGCTGATCAGGT-3’，正向引物自5’端第4到9位是XhoI酶切位點，反向引物從5’端起第3到8位是XbaI酶切位點，從銅綠假單孢桿菌中擴增出腺苷硫酸還原酶編碼基因(APR基因)，該PCR產物中的APR基因的編碼序列是SEQ ID N0.3的第1196-1996位，編碼SEQ ID N0.4的第65-330位所示的腺苷硫酸還原酶APR。 將APR基因的PCR產物用XhoI和XbaI雙酶切后插入載體p0SB208的XhoI和XbaI位點，得到載體p0SB208-APR。p0SB208-APR中含有腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒，該腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒的核苷酸序列是SEQ ID N0.3。SEQ ID N0.3由2586個核苷酸組成，為腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒的核苷酸序列，第1-1003位為35S啟動子序列，第1004-1189位為葉綠體弓I導肽基因序列，第1196-1996位為腺苷硫酸還原酶APR基因序列，第1004-1996位為葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR的基因序列，第1997-2586位為ocs終止子序列。SEQ ID N0.3的第1004-1996位所示的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR的基因編碼SEQ ID N0.4所示的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白TP-APR。SEQ ID N0.4的第1_62位為葉綠體引導肽TP的氨基酸序列，SEQ IDN0.4的第65-330位為腺苷硫酸還原酶APR的氨基酸序列。3、pCAMBIAK_APR 的構建通過電轉化將載體p0SB108-AK和目的載體pDES200共轉化到帶有Cre蛋白的大腸桿菌SW106中，通過Cre/loxP同源重組整合，經過氨芐青霉素和卡那霉素的雙重篩選，得到抗性菌種，提質粒，用1-scel內切酶切掉T載體骨架，再用T4DNA連接酶進行自連后得到重組載體PDES200-AK，然后pDES200-AK再和質粒p0SB208_APR進行第二輪的Cre/1xP同源重組，共轉化大腸桿菌SW106，經過氨芐青霉素和卡那霉素的雙重篩選，用AscI內切酶切掉T載體骨架，自連得到共表達載體pDESAK-APR。分別用EcoRI和Hind III雙酶切 pDESAK-APR 及 pCAMBIA2300 (pCAMBIA-2300，其全序列見 GenBank:AF234315.1，updatedate是2010年11月16日))，回收雙酶切pDESAK-APR得到的小片段(含有SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒和SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達盒)和雙酶切PCAMBIA2300得到的大片段，然后再用T4DNA連接酶連接，獲得含有SEQ IDN0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒和SEQ ID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達盒的重組植物表達載體pCAMBIAK-APR (圖1)。pCAMBIAK-APR的AscI酶切鑒定結果和pCAMBIAK-APR的1-scel酶切鑒定結果如圖2所示。 二、pCAMBIAK-APR轉化苜蓿培育氨基酸含量改變的轉基因苜蓿1.農桿菌感受態細胞的制備挑取根癌農桿菌EHA105單菌落接種于5ml YEP (含75mg/L利福平)液體培養基，280C，250rpm,振蕩培養過夜；將菌液按1:100轉移至200mlYEP (含75mg/L利福平)培養液中，28°C，250rpm，振蕩培養至0D600=0.4(約4_5h);轉入250ml的無菌離心瓶，4°C，4000rpm離心IOmin,棄上清；加入IOml預冷的0.15M的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置20min ;4°C，5000rpm離心5min，去上清，加入4ml預冷的含有10%甘油的0.15M的CaCl2溶液，輕輕懸浮；每管100 μ L分裝于1.5mL無菌的EP管中，_80°C保存。2.表達載體pCAMBIAK-APR轉化農桿菌EHA105:取I μ g的表達載體質粒pCAMBIAK-APR的DNA加入到200 μ I ΕΗΑ105感受態細胞中，混勻；液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，加入Iml YEP液體培養基，28°C 150rpm振蕩培養4h ; IOOOOrpm離心30sec，棄上清，加入0.1ml YEP液體培養基，重新懸浮細胞；涂布于含50 μ g/ml Kan(卡那霉素)和125 μ g/ml利福平的YEP固體平板上，28°C培養大約48h ;挑取平板上長出的單菌落，接種于YEP液體培養液(含50 μ g/ml Kan和125 μ g/ml利福平)中，28°C 220rpm振蕩過夜培養。長出的單菌落用PCR鑒定，鑒定用的引物是上述步驟一的AK和APR基因的擴增引物，結果顯示載體pCAMBIAK-APR已經成功轉入農桿菌中。3.農桿菌轉化苜蓿:I)植物受體材料的準備:選取紫花苜蓿品種保定苜蓿的飽滿種子在75%的酒精中浸泡2min,然后在0.1%的氯化萊溶液中消毒IOmin,再用無菌水沖洗3 — 5次,接種在1/2MS培養基上發芽。5天后取長出的子葉和下胚軸，子葉以橫向切成2 — 3_寬的小條，下胚軸切成2 — 4mm長的小段,用于轉化試驗。2)農桿菌菌液的制備:將含有植物表達載體pCAMBIAK-APR的農桿菌EHA105接種于YEB培養液(加入卡那霉素)中，加入乙酰丁香酮(AS)至終濃度50-200 μ m。28°C振蕩培養至0D600為0.6-0.8，4000rpm離心5分鐘，去上清，沉淀用SH液體培養基將菌液稀釋5倍，加入乙酰丁香酮(AS)至終濃度50-200 μ m。3)切好的苜蓿子葉和下胚軸在稀釋的農桿菌菌液中浸泡10 - 30分鐘。4)用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉入上鋪一層濾紙的SH基本培養基(力口入AS至終濃度50-200 μ m)，置25°C暗培養。5)三天后，將材料轉到含有相應抗生素的SH愈傷組織保持培養基(SH培養基+
0.025mg/L KT + 2mg/L2, 4_D + 20_25mg/L卡那霉素+ 500mg/L羧芐青霉素)中培養兩周。6)兩周后，將生長良好的愈傷組織夾成小塊，轉到新的含有抗生素的SH愈傷保持培養基(SH 培養基 + 0.05mg/L KT + 2mg/L2, 4_D + 20_25mg/L 卡那霉素+ 500mg/L 羧芐
青霉素)中繼續培養兩周。7)兩周后，將生長良好的愈傷組織夾成小塊，轉到新的含有抗生素的SH愈傷保持培養基(SH培養基+ 0.lmg/L KT + 2mg/L2, 4_D + 20mg/L卡那霉素+ 200mg/L羧芐青霉素)中繼續培養兩周。8)兩周后，將生長良好的 愈傷組織夾成小塊，轉到新的含有抗生素的SH分化培養(SH培養基+ 0.4mg/L KT + 20mg/L卡那霉素+ 200mg/L羧芐青霉素)中繼續培養兩周，繼代一次。9)待抗性芽生長至2 - 3cm高時，切下小芽轉入生根培養基(1/2MS基本培養基)中誘導生根；10)待根長至足夠10 - 20cm長(約3周)，且具有一定數量即可去掉封口膜。4、轉基因苜蓿的篩選和檢測經過抗生素篩選的再生苗進行分子生物學檢測:a、DNA水平檢測以Ttl代轉pCAMBIAK-APR各卡那霉素抗性株系的基因組DNA為模板，質粒pCAMBIAK-APR為陽性對照，未轉化的保定苜蓿(野生型，WT)為陰性對照，以正向引物5，-GACGCACAATCCCACTATCC-3’(對應于 35S 啟動子)和反向引物 5’ -TCTAGATTACTCAAACAAATTACTAT-3’，PCR擴增 35S 啟動子-AK 基因片段，以正向引物 5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’(對應于 35S 啟動子)和反向引物 5’ -GCTCTAGATCAGGCCTTGCTGATCAGGT-3’ PCR 擴增 35S 啟動子-APR基因片段。這兩個PCR的反應體系均為:
權利要求
1.培育氨基酸含量改變的轉基因苜蓿的方法，包括向受體苜蓿中導入天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因，得到氨基酸含量改變的轉基因苜蓿； 所述轉基因苜蓿具有下述I)-4)中的全部特性或至少一種特性: 1)所述轉基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，甲硫氨酸含量提高； 2)所述轉基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，半胱氨酸含量提高； 3)所述轉基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，天冬氨酸含量提高； 4)所述轉基因苜蓿與所述受體苜蓿相比，賴氨酸含量提高； 所述天冬氨酸激酶是如下a)或b)的蛋白質: a)氨基酸序列如SEQ ID N0.2第65-512位所示的蛋白質； b)將SEQ ID N0.2第65-512位經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有天冬氨酸激酶活性的由a)衍生的蛋白質； 所述腺苷硫酸還原酶是如下c)或d)的蛋白質: c)氨基酸序列如SEQ ID N0.4第65-330位所示的蛋白質； d)將SEQ ID N0.4第65-330位經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有腺苷硫酸還原酶活性的由c)衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述天冬氨酸激酶編碼基因為如下I)或2)或3)或4)所示的基因,和/或所述腺苷硫酸還原酶為如下5)或6)或7)或8)所示的基因: 1)編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子； 2)其編碼序列是SEQID N0.1的第1196-2542位核苷酸的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子； 4)與I)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述天冬氨酸激酶的DNA分子; 5)編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子； 6)其編碼序列是SEQID N0.3的第1196-1996位核苷酸的DNA分子； 7)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子； 8)與I)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述腺苷硫酸還原酶的DNA分子。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因通過天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達載體導入所述受體苜蓿；所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達載體含有天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒；所述天冬氨酸激酶編碼基因表達盒包括啟動子I和由所述啟動子I啟動的葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因和終止所述葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因轉錄的終止子I;所述葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因是所述天冬氨酸激酶編碼基因與所述葉綠體引導肽基因相連接形成的融合基因，所述葉綠體引導肽基因位于所述天冬氨酸激酶編碼基因的上游； 所述腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒包括啟動子2和由所述啟動子2啟動的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合基因和終止所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白基因轉錄的終止子2 ;所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白基因是所述腺苷硫酸還原酶編碼基因與所述葉綠體引導肽基因相連接形成的融合基因，所述葉綠體引導肽基因位于所述腺苷硫酸還原酶編碼基因的上游。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合基因序列如SEQ ID N0.1的第1004-2542位所示；所述葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合基因序列如SEQ ID N0.3的第1004-1996位所示；所述啟動子I和啟動子2均是35s，所述終止子I和所述終止子2均是ocs。
6.根據權利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于:所述天冬氨酸激酶編碼基因表達盒的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒的核苷酸序列如SEQ ID N0.3 所示。
7.根據權利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于:所述天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達載體是在PDES200的1xp位點插入所述天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒得到的重組表達載體。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述受體苜蓿為紫花苜蓿。
9.SEQ ID N0.2所示的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白和SEQ ID N0.4所示的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合蛋白。
10.A-E中的任一種生物材料: A、在pCAMBIA2300的多克隆位點插入SEQID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒得到的重組表達載體； B、含有SEQID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒的表達載體； C、SEQID N0.1所示的天冬氨酸激酶編碼基因表達盒和SEQ ID N0.3所示的腺苷硫酸還原酶編碼基因表達盒； D、SEQID N0.2所示的融合蛋白的編碼基因和SEQ ID N0.4所示的融合蛋白的編碼基因； E、SEQID N0.1的第1004-2542位所示的葉綠體引導肽天冬氨酸激酶融合基因；SEQ IDN0.3的第1004-1996位所示的葉綠體引導肽腺苷硫酸還原酶融合基因。
全文摘要
本發明公開了培育高含硫氨基酸的轉基因苜蓿的方法及其專用材料。本發明的培育氨基酸含量改變的轉基因苜蓿的方法，包括向受體苜蓿中導入天冬氨酸激酶編碼基因和腺苷硫酸還原酶編碼基因，得到氨基酸含量改變的轉基因苜蓿；所述天冬氨酸激酶是氨基酸序列如SEQ ID No.2第65-512位所示的蛋白質；所述腺苷硫酸還原酶是氨基酸序列如SEQ ID No.4第65-330位所示的蛋白質。本發明培育的氨基酸含量改變的轉基因苜蓿的甲硫氨酸含量顯著高于受體苜蓿——未轉化保定苜蓿(野生型)，是野生型的1.5倍；轉pCAMBIAK-APR株系的半胱氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.2倍，轉pCAMBIAK-APR株系的天冬氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.4倍；轉pCAMBIAK-APR株系的賴氨酸含量顯著高于野生型，是野生型的1.5倍。
文檔編號C12N15/62GK103215305SQ20131008627
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者王濤, 仝宗永, 董江麗 申請人:中國農業大學