專利名稱：試管慈姑組織培養快速繁殖的方法
技術領域：
本發明屬于農業育種領域，具體地指一種試管慈姑組織培養快速繁殖的方法。
背景技術：
慈姑為多年生水生草本植物，以其球莖供食用，我國是慈姑原產地之一，長江流域及其以南各省普遍栽培，太湖沿岸及珠江三角洲為主產區，北方少量栽培。慈姑主要以慈姑球莖或球莖頂芽作種進行無性繁殖，繁殖系數低，一年只繁殖一代，用種量大，限制了慈姑新優品種的推廣速度。因此，通過組織培養快速繁殖進行試管慈姑的生產是解決上述問題的有效途徑之一。現階段，慈姑的組織培養研究工作主要由國內研究人員進行，而國外對其研究較少。貴州師范大學等開展了一些研究工作，但只得到慈姑試管苗和匍匐莖。慈姑試管苗和匍匐莖不利于遠距離運輸和忙存。
發明內容
本發明的目的是針對無性繁殖的慈姑的種球帶病和種性退化問題，提供一種試管慈姑組織培養快速繁殖的方法，提高慈姑的品質。本發明試管慈姑組織培養快速繁殖的方法，包括以下步驟:I)外植體的消毒處理:選取無病蟲危害的慈姑球莖，清洗干凈后，切取球莖頂芽為外植體，流水沖洗20 35min，濾干后剝去最外面I 2層鱗片進行消毒處理，先用質量分數為72%硫酸鏈霉素處理10 30min，再用質量分數為70%乙醇表面消毒20 40s，最后用質量分數為0.l%HgCl2溶液處理2 5min ；
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2)莖尖分化:消毒處理后的慈姑用無菌水沖洗4 5次，剝去2 3層鱗片，切取莖尖接種于啟動培養基上，所述啟動培養基為1/2MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)1.0 2.0mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1 0.5mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為O
0.5%的瓊脂，pH值為5.8 6.0，培養溫度25°C 28°C，光照強度1000 1500 lx，每天光照時間10h，直至長成再生小植株；3)繼代增殖:將莖尖誘導的再生小植株轉接到增殖培養基中進行繼代增殖培養，所述增殖培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)1.0 3.0 mg/L、萘乙酸(NAA)
0.1 0.3mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為O 0.5%的瓊脂，pH值為5.8 6.0，培養溫度251: 281:，光照強度1000 1500 lx，每天光照時間10h，直至萌發形成分株的慈姑試管苗；4)誘導試管慈姑:將慈姑試管苗轉接到誘導培養基上，所述誘導培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)0 3.0mg/L、萘乙酸(NAA)O 0.3mg/L、活性炭(AC)0.5
1.0g/L、質量分數為3.0% 8.0%的蔗糖和質量分數為O 0.5%的瓊脂，pH值為5.8
6.0，在培養溫度14°C 22°C，每天光照時間O 12h的條件下誘導形成試管慈姑。本發明在外植體的消毒處理中，延長了質量分數為72%硫酸鏈霉素的處理時間，相應縮短了 0.1%升汞的處理時間。因為升汞(HgCl2)的毒性很大，在對外植體進行消毒的同時，也對外植體造成很大的傷害，重則導致材料死亡，所以在對消毒處理步驟優化后，可以將慈姑莖尖成活率提高了 5 10個百分點。本發明在莖尖分化階段中，選擇慈姑莖尖分化啟動培養基中的基本培養基為1/2MS培養基，將MS的大量元素進行減半。這樣，由于降低了無機鹽的濃度更加有利于根的分化，從而將慈姑莖尖分化率提高了 2 3個百分點，同時也降低了培養基的成本。本發明在繼代增殖階段中，由于6-BA濃度高易導致組培試管苗分化過多，苗小，生長慢，有畸形苗，且6-BA的累積易引起組培試管苗玻璃化，造成組培試管苗死亡率高，且性狀難以穩定。因此，通過優化增殖培養基中6-BA的濃度，在降低增殖培養基中6-BA的濃度的同時又能提高組培試管苗的成活率。本發明在誘導試管慈姑階段中，在誘導培養基中添加了活性炭AC。AC的添加不僅給試管慈姑提供了更加適于誘導的暗環境，還可吸附離體培養中的抑制物，同時AC對高質量濃度的6-BA和NAA等也產生一定的吸附作用，有利于誘導出更多、更大且整齊度高的試管慈姑。本發明通過組織培養進行試管慈姑的繁殖，具有以下優點:第一，繁殖系數高，繁殖周期短，且整個繁殖過程均在人工控制的條件下進行，不受外界環境影響，可以進行周年生產，一年可繁殖6 8代；而慈姑常規生產用種一年只可繁殖一代。本發明極大提高了慈姑的繁殖速度，有利于優新慈姑品種的推廣應用。第二，試管慈姑因其體積小、重量輕，既便于遠程運輸，又減少了用種的損耗率節約了運輸費用，解決了慈姑試管苗不利于遠程運輸和貯存的問題。常規慈姑單個重25 40g,傳統生產方式每畝用種量為100kg,而單個試管慈姑僅重0.1 0.3g,每畝用種量
0.4 1.2kg，可節約運輸費 用80%以上，減少用種損耗率20%以上。第三，試管慈姑不帶病，解決了慈姑常規用種易帶病的問題。通過莖尖組培快繁得到的試管慈姑不帶病，田間生長抗病能力強，表現為植株高大，葉色濃綠，莖桿粗壯，生長勢強。第四，試管慈姑的誘導將為球莖膨大機理的研究工作提供一個可操作的簡單系統。第五，作為離體休眠器官，還可以進行慈姑種質資源離體室內保存研究，且有利于國際間種質資源的活體交換。綜上所述，本發明為慈姑產業的發展提供了一種快速、方便、有效的繁殖方法。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明作進一步的詳細描述。實施例1以江蘇地方品種寶應紫圓慈姑(俗稱“刮老烏”)的頂芽為外植體，經過外植體的消毒處理、莖尖分化、繼代增殖、誘導形成試管慈姑，包括如下步驟:I)外植體的消毒處理:選取無病蟲危害的慈姑球莖，清洗干凈后，切取球莖頂芽為外植體，流水沖洗約30min，濾干后置超凈工作臺上剝去最外面2層鱗片進行消毒處理，即先用質量分數為72%硫酸鏈霉素處理30min，再用質量分數為70%乙醇表面消毒30s，最后用質量分數為0.l%HgCl2溶液處理3min ；2)莖尖分化:消毒處理后的慈姑用無菌水沖洗5次，用解剖刀剝去3層鱗片，將莖尖剝離至僅剩2個葉原基，切取莖尖0.5cm接種于啟動培養基上。所用啟動培養基為1/2MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)l.0mg/L、萘乙酸(NAA)0.2mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖，PH值為6.0，在溫度為28°C，光照強度為1000 Ix下，每天光照10h，30d即可長成具有4葉的再生小植株；3)繼代增殖:將莖尖誘導的再生小植株轉接到增殖培養基中進行繼代增殖培養，所用增殖培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA) 2.0 mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖，pH值為6.0，在溫度為28°C，光照強度為1200 Ix下，每天光照10h，40d萌發形成分株的慈姑試管苗；4)誘導試管慈姑:將慈姑試管苗轉接到誘導培養基上，所用誘導培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)l.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.lmg/L、活性炭(AC)1.0g/L、質量分數為6.0%的蔗糖，pH值為6.0，在溫度22°C，全黑暗條件下，60d以后誘導形成試管慈姑。實施例2以江蘇地方品種寶應紫圓慈姑(俗稱“刮老烏”)的頂芽為外植體，經過外植體的消毒處理、莖尖分化、繼代增殖、誘導形成試管慈姑，包括如下步驟:I)外植體的消毒處理:選取無病蟲危害的慈姑球莖，清洗干凈后，切取球莖頂芽為外植體，流水沖洗約25min，濾干后置超凈工作臺上剝去最外面2層鱗片進行消毒處理，即先用質量分數為72%硫酸鏈霉素處理20min，再用質量分數為70%乙醇表面消毒40s，最后用質量分數為0.l%HgCl2溶液處理5min ；2)莖尖分化:消毒處理后的慈姑用無菌水沖洗5次，用解剖刀剝去3層鱗片，將莖尖剝離至僅剩2個葉原基，切取莖尖0.5cm接種于啟動培養基上。所用啟動培養基為1/2MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)l.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.4mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為0.5%的瓊脂，pH值為5.8，在溫度為25°C°C，光照強度為1000 Ix下，每天光照10h，32d即可長成具有7葉的再生小植株；3)繼代增殖:將莖尖誘導的再生小植株轉接到增殖培養基中進行繼代增殖培養，所用增殖培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)1.0 mg/L、萘乙酸(NAA) 0.2mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為0.2%的瓊脂，pH值為5.8，在溫度為25°C，光照強度為1500 Ix下，每天光照10h，35d萌發形成分株的慈姑試管苗；4)誘導試管慈姑:將慈姑試管苗轉接到誘導培養基上，所用誘導培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.lmg/L、活性炭(AC)1.0g/L、質量分數為7.0%的蔗糖和質量分數為0.3%的瓊脂，pH值為5.8，在溫度20°C，每天光照時間4h的條件下，55d以后誘導形成試管慈姑。實施例3以江蘇地方品種寶應紫圓慈姑(俗稱“刮老烏”)的頂芽為外植體，經過外植體的消毒處理、莖尖分化、繼代增殖、誘導形成試管慈姑，包括如下步驟:I)外植體的消毒處理:選取無病蟲危害的慈姑球莖，清洗干凈后，切取球莖頂芽為外植體，流水沖洗約35min ，濾干后置超凈工作臺上剝去最外面I層鱗片進行消毒處理，即先用質量分數為72%硫酸鏈霉素處理lOmin，再用質量分數為70%乙醇表面消毒30s，最后用質量分數為0.l%HgCl2溶液處理2min ；2)莖尖分化:消毒處理后的慈姑用無菌水沖洗5次，用解剖刀剝去3層鱗片，將莖尖剝離至僅剩I個葉原基，切取莖尖0.5cm接種于啟動培養基上。所用啟動培養基為1/2MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L、萘乙酸(NAA) 0.4mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為0.2%的瓊脂，pH值為6.0，在溫度為28°C，光照強度為1200 Ix下，每天光照10h，35d即可長成具有4葉的再生小植株；3)繼代增殖:將莖尖誘導的再生小植株轉接到增殖培養基中進行繼代增殖培養，所用增殖培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)3.0 mg/L、萘乙酸(NAA) 0.2mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為0.4%的瓊脂，pH值為5.8 6.0，在溫度為25°C°C，光照強度為1500 Ix下，每天光照10h，40d萌發形成分株的慈姑試管苗；4)誘導試管慈姑:將慈 姑試管苗轉接到誘導培養基上，所用誘導培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA) 3mg/L、活性炭(AC) 0.5g/L、質量分數為8.0%的蔗糖和質量分數為0.3%的瓊脂，pH值為6.0，在溫度20°C，每天光照時間8h的條件下，55d以后誘導形成試管慈姑。實施例4以江蘇地方品種寶應紫圓慈姑(俗稱“刮老烏”)的頂芽為外植體，經過外植體的消毒處理、莖尖分化、繼代增殖、誘導形成試管慈姑，包括如下步驟:I)外植體的消毒處理:選取無病蟲危害的慈姑球莖，清洗干凈后，切取球莖頂芽為外植體，流水沖洗約30min，濾干后置超凈工作臺上剝去最外面I層鱗片進行消毒處理，即先用質量分數為72%硫酸鏈霉素處理15min，再用質量分數為70%乙醇表面消毒25s，最后用質量分數為0.l%HgCl2溶液處理4min ；2)莖尖分化:消毒處理后的慈姑用無菌水沖洗4次，用解剖刀剝去3層鱗片，將莖尖剝離至僅剩2個葉原基，切取莖尖0.5cm接種于啟動培養基上。所用啟動培養基為1/2MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)1.7mg/L、萘乙酸(NAA) 0.3mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖，pH值為6.0，在溫度為25°C，光照強度為1300 Ix下，每天光照10h，35d即可長成具有6葉的再生小植株；3)繼代增殖:將莖尖誘導的再生小植株轉接到增殖培養基中進行繼代增殖培養，所用增殖培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤(6-BA) 2.2 mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為0.1%的瓊脂，pH值為6.0，在溫度為25°C，光照強度為1400 Ix下，每天光照10h，40d萌發形成分株的慈姑試管苗；4)誘導試管慈姑:將慈姑試管苗轉接到誘導培養基上，所用誘導培養基為MS培養基、添加萘乙酸(NAA) 0.3mg/L、活性炭(AC) 0.8g/L、質量分數為5.0%的蔗糖，pH值為6.0，在溫度14°C，每天光照時間12h的條件下，60d以后誘導形成試管慈姑。
權利要求
1.一種試管慈姑組織培養快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)外植體的消毒處理:選取無病蟲危害的慈姑球莖，清洗干凈后，切取球莖頂芽為外植體，流水沖洗20 35min，濾干后剝去最外面I 2層鱗片進行消毒處理，先用質量分數為72%硫酸鏈霉素處理10 30min，再用質量分數為70%乙醇表面消毒20 40s，最后用質量分數為0.l%HgCl2溶液處理2 5min ； 2)莖尖分化:消毒處理后的慈姑用無菌水沖洗4 5次，剝去2 3層鱗片，切取莖尖接種于啟動培養基上，所述啟動培養基為1/2MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤1.0 2.0mg/L、萘乙酸0.1 0.5mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為O 0.5%的瓊脂，pH值為.5.8 6.0，培養溫度25°C 28°C，光照強度1000 1500 lx，每天光照時間10h，直至長成再生小植株； 3)繼代增殖:將莖尖誘導的再生小植株轉接到增殖培養基中進行繼代增殖培養，所述增殖培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤1.0 3.0 mg/L、萘乙酸0.1 0.3mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為O 0.5%的瓊脂，pH值為5.8 6.0，培養溫度25°C 28°C，光照強度1000 1500 lx，每天光照時間10h，直至萌發形成分株的慈姑試管苗； 4)誘導試管慈姑:將慈姑試管苗轉接到誘導培養基上，所述誘導培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤O 3.0mg/L、萘乙酸O 0.3mg/L、活性炭0.5 1.0g/L、質量分數為.3.0% 8.0%的蔗糖和質量分數為O 0.5%的瓊脂，pH值為5.8 6.0，在培養溫度14°C 22°C，每天光照時 間 O 12h的條件下誘導形成試管慈姑。
全文摘要
本發明公開了一種試管慈姑組織培養快速繁殖的方法，經過外植體的消毒處理、莖尖分化、繼代增殖、誘導形成試管慈姑。本發明通過組織培養進行試管慈姑的繁殖，繁殖系數高，繁殖周期短，且整個繁殖過程均在人工控制的條件下進行，不受外界環境影響，可以進行周年生產；試管慈姑因其體積小、重量輕、可以解決慈姑試管苗遠程運輸和貯存過程中的問題；試管慈姑不帶病，解決了慈姑常規用種易帶病的問題；試管慈姑的誘導將為球莖膨大機理的研究工作提供一個可操作的簡單系統；作為離體休眠器官，還可以進行慈姑種質資源離體室內保存研究，且有利于國際間種質資源的活體交換。本發明為慈姑產業的發展提供了一種快速、方便、有效的繁殖方法。
文檔編號A01H4/00GK103070073SQ20131002427
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月22日 優先權日2013年1月22日
發明者朱紅蓮, 柯衛東, 劉玉平, 彭靜, 黃新芳, 劉義滿, 李峰, 李雙梅, 黃來春, 葉元英 申請人:武漢市蔬菜科學研究所