一種裸花紫珠脫毒微繁方法
【專利摘要】本發明提供一種裸花紫珠脫毒微繁方法，涉及利用植物脫毒微繁殖及組織培養的方法，解決裸花紫珠繁殖周期長、增殖效率低和成本高的問題。方法：①外植體消毒；②無菌苗培養；③微枝培養，將增生的無菌苗轉接于壯苗培養基中培養；④增殖培養，將增壯后的微枝切割成帶有1個頂芽或1～2個腋芽進行培養；⑤生根培養，待微枝生長長度為2.0～3.0cm，轉接于生根培養基中；⑥煉苗培養，將生根培養的裸花紫珠苗于蔭棚煉苗7～10d；⑦將經過煉苗后裸花紫珠苗移栽于育苗杯，即完成裸花紫珠的脫毒微繁。本發明中裸花紫珠的脫毒微繁方法，具有繁殖周期短，增殖率高、苗木性狀一致、成本低、生根率和移苗成活率高、生長周期不受季節限制等優點。
【專利說明】一種裸花紫珠脫毒微繁方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種裸花紫珠的組培快速繁殖的技術，本發明屬于種子種苗、農業生 物技術和藥用植物栽培領域。
[0002]
【背景技術】
[0003] H繁HCallecarpa. nudiflora Hook, et Arn)為馬鞭草科紫珠屬植物，以 其干燥葉片入藥，收載于《中國藥典》1977年版。具有止血散瘀、抗菌消炎之功效，是裸花 紫珠片、裸花紫珠分散片、裸花紫珠膠囊、裸花紫珠顆粒、裸花紫珠栓等近40余種中成藥的 重要原料。由于裸花紫珠為重要的醫藥原料，野生資源破壞嚴重，采集野生資源已經不能滿 足生產需要，開展規范化生產是解決藥材短缺的有效途徑，而種苗繁育是規范化生產的重 要組成部分，由于裸花紫珠果實成熟周期較長，種子成熟度不一，加上種子狹小，種皮堅硬， 于是裸花紫珠種苗繁育周期較長，出苗不一致，遠遠不能滿足市場的需要，這使裸花紫珠在 我國境內的推廣栽培和資源利用受到了極大的限制。
[0004] 利用植物組織培養技術建立裸花紫珠脫毒微繁體系是生產優質裸花紫珠優質種 苗的有效途徑，其關鍵技術之一在于脫毒方法的建立、微枝培養、增殖培養和生根培養，不 同激素組合及其濃度對此影響很大。CN102870678A公開了一種組織培養快速繁殖裸花紫珠 的方法，通過利用扦插繁殖的裸花紫珠的新枝為外植體，進行接種培養、擴繁培養、生根培 養、煉苗移栽。國內外尚未見到裸花紫珠果實外植體的組織培養、脫毒微繁等研究的報道， 本專利通過對脫毒方法的建立、微枝培養、增殖培養和生根培養，建立了裸花紫珠種子外植 體的脫毒微繁方法，為裸花紫珠種苗的工業化生產的奠定了基礎。
[0005]
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是為了解決裸花紫珠繁殖周期長、增殖效率低、成本高和遺傳穩定 性差的問題，而提供的一種低成本、穩定一致、增殖效率高的裸花紫珠脫毒微繁方法。
[0007] 裸花紫珠的脫毒微繁方法按以下步驟實現：①外植體消毒，將清洗后的裸花紫珠 果實外植體在超凈工作臺上用質量濃度為75%的乙醇溶液浸泡30?60s后，然后用無菌 水沖洗3?5次，再用質量濃度為0. 1%的氯化汞溶液消毒12?15min，然后用無菌水沖 洗3?5次；②無菌苗培養，將種子從消毒后的果實外植體中剝離出，接種于以改良MS固 體培養基為基本培養基，且還包含0. Of 0. 03mg/L的赤霉素、0. Of 0. 03 mg/L的NAA和質 量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的誘導培養基，然后在溫度為25?28°C、 濕度為70%?80%、光照強度為80?100 lx、光照8?10 h/d的條件下培養至無菌芽長度 為0. 5?I. 0 cm ;③微枝培養，將增生的無菌芽一起轉接于以改良MS固培養基為基本培養 基，且還包含質量濃度為0. 5?1. 0%的有機附加物，質量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為 5. 6?6. 0的壯苗培養基中，在溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強度為50?70 lx、光照8?10 h/d的條件下培養至無菌芽生長長度為15. O?20. O cm,即為微枝；④增殖 培養，將增壯后的微枝切割成帶有1個頂芽或1?2個腋芽、且長度為I. 0?2. 0 cm的莖 段然后接種于以改良MS固培養基為基本培養基，且還包含0. 5?0. 8mg/L的6-BA、0. 08? 0. I mg/L的NAA和質量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的增殖培養基，在溫度 為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強度為80?100 lx、光照8?10 h/d的條件下培 養，視種苗需求數量可增殖25?30d ;⑤生根培養，待微枝生長長度為2. 0?3. 0 cm，轉接 于以改良MS固體培養基為基本培養基且還含0. 1%?1. 0%活性炭或0. 05?0. I mg/L的 NAA和質量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的生根培養基中進行生根培養，在 溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強度為80?100 lx、光照8?10 h/d的條件 下培養至裸花紫珠微枝根的生長長度為1. 5?2. 0 cm ;⑥煉苗培養，將生根培養的裸花紫 珠苗于隱蔽度為15%?20%的蔭棚，煉苗7?10 d ;⑦將經過煉苗后裸花紫珠苗移栽于含 10%?15%蛭石，10%?15%牛糞，10%?15%椰糠和55%?70%腐殖土的育苗杯，即完成裸 花紫珠的脫毒微繁。
[0008] 上述方案中，所述的改良MS固體培養基由1/2MS培養基，增加75. (Γ100. 0 mg/L 的肌醇制得。
[0009] 作為本發明的優選方案，本發明中步驟②無菌苗培養為：將消毒后的裸花紫珠種 子接種于以改良MS固培養基為基本培養基，且還包含0. 01mg/L的赤霉素、0. 01 mg/L的NAA 和質量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的誘導培養基。
[0010] 作為本發明的優選方案，本發明中步驟③中，所述壯苗培養基中有機附加物為椰 子乳、土豆泥、胡蘿卜泥中的一種或多種，進一步優選方案為有機附加物為質量濃度為0. 5% 的椰子乳或1. 5% 土豆泥或1. 5%胡蘿卜泥。
[0011] 作為本發明的優選方案，本發明中步驟④增殖培養中，所述的增殖培養基中6-BA 濃度為 〇· 5mg/L，NAA 濃度為 0· 10mg/L。
[0012] 以下通過如下實驗詳細描述本發明的技術方案： 實驗材料 本發明中實驗所用的裸花紫珠種子為2011年12月份?2012年1月份在海南省儋州、 五指山、白沙、海口等市縣采收的白色成熟的裸花紫珠 WJicarjDa /W￡/i/7ora Hook. Et Arn)果實為實驗材料。
[0013] 本發明中所用培養基均含質量濃度為2. 5~3· 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0。
[0014] 實驗一：裸花紫珠外植體消毒 一、實驗方法 將裸花紫珠種子分為6組，用75%酒精30?60s和升汞消毒7?15min，無菌水漂洗5 次至pH=7,重復3次，置于30°C恒溫培養箱全光照培養，于10?12d后統計污染率與增殖 率。
[0015] 本實驗中污染率是指接種IOd后被細菌或真菌污染的外植體瓶數占總接種瓶數 的百分率；褐化率是指接種IOd后外植體褐化變黑的瓶數占總接種瓶數的百分率；增殖率 是指接種IOd后外植體開展生長的瓶數占總接種瓶數的百分率；增殖系數是指接種30d后， 與原接種量相比，增殖的倍數百分率。
[0016] 二、實驗結果 如表1所示，（1)控制升汞消毒時間為lOmin，考察75%酒精消毒時間對消毒效果的影 響，結果表明：當升汞消毒時間為10min，30s、45s和60s的酒精消毒對裸花紫珠果實的消毒 效果影響不大，其污染率23±3%，增殖率為77%±3% ; (2)控制酒精消毒時間為30s和60 s， 考察〇. 1%升汞消毒時間對消毒效果的影響，結果表明：消毒效果隨升汞消毒時間的遞增而 愈好，其中控制酒精消毒時間為30s，0. 1%升汞消毒時間為12min，其污染率12±2%，增殖率 為88%±2% ;酒精消毒時間為30s，0. 1%升汞消毒時間為15min，其污染率10±2%，增殖率為 90%±2%。所以從本研究得出以下結論：（1)裸花紫珠果實的最佳消毒程序為75%酒精消毒 3(T60s，0. 1%升汞消毒時間為12mirTl5 min，其污染率在10%，增殖率為90%。
[0017] 表1 消毒時間對消毒效果的影響
【權利要求】
1. 一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于裸花紫珠的脫毒微繁方法按以下步驟實 現：①外植體消毒，將清洗后的裸花紫珠果實外植體在超凈工作臺上用質量濃度為75%的 乙醇溶液浸泡3(T60s后，然后用無菌水沖洗3?5次，再用質量濃度為0. 1%的氯化汞溶液 消毒12?15min，然后用無菌水沖洗3?5次；②無菌苗培養，將種子從消毒的裸花紫珠果 實中剝離出，接種于誘導培養基，在溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強度為80? 100 lx、光照8?10 h/d的條件下培養至無菌芽長度為0.5?1.0 cm;③微枝培養，將增 生的無菌芽一起轉接于壯苗培養基中，在溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強度為 50?70 lx、光照8?10 h/d的條件下培養至無菌芽生長長度為15. 0?20. 0 cm,即為微 枝；④增殖培養，將增壯后的微枝切割成帶有1個頂芽或1?2個腋芽、且長度為1. 0?2. 0 cm的莖段然后接種于增殖培養基，在溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強度為80? 100 lx、光照8?10 h/d的條件下培養，視種苗需求數量可增殖25?30d ;⑤生根培養，待 微枝生長長度為2. 0?3. 0 cm，轉接于生根培養基中進行生根培養，在溫度為25?28°C、 濕度為70%?80%、光照強度為80?100 lx、光照8?10 h/d的條件下培養至裸花紫珠微 枝根的生長長度為1. 5?2. 0 cm ;⑥煉苗培養，將生根培養的裸花紫珠苗于隱蔽度為15%? 20%的蔭棚，煉苗7?10 d ;⑦將經過煉苗后裸花紫珠苗移栽于含10%?15%蛭石，10%? 15%牛糞，10%?15%椰糠和55%?70% 土壤的育苗杯，即完成裸花紫珠的脫毒微繁；其中步 驟②中誘導培養基是以改良MS固體培養基為基本培養基，且還包含0. 01~0. 03mg/L的赤霉 素、0· 01~0· 03mg/L的NAA和質量濃度為2. 5~3· 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0 ;步驟③中壯 苗培養基是以改良MS固培養基為基本培養基，且還包含質量濃度為0. 5?1. 0%的有機附 加物，質量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0 ;步驟④中增殖培養基是以改良MS 固培養基為基本培養基，且還包含〇. 5?0. 8mg/L的6-BA、0. 08?0. 1 mg/L的NAA和質量 濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0 ;步驟⑤中生根培養基是以改良MS固培養基 為基本培養基，且還包含0. 1%?1. 0%的活性炭或0. 05?0. 1 mg/L的NAA和質量濃度為 2. 5?3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0。
2. 根據權利要求1所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于所述的改良MS固 體培養基由1/2MS培養基，增加75. (Γ100. 0 mg/L的肌醇制得。
3. 根據權利要求1或2所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于步驟②中將 消毒后的裸花紫珠種子接種于以改良MS固培養基為基本培養基，且還包含0. 01mg/L的赤 霉素、0. 01mg/L的NAA和質量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的誘導培養基。
4. 根據權利要求1或2所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于步驟③中，所 述壯苗培養基中有機附加物為椰子乳、土豆泥、胡蘿卜泥中的一種或多種。
5. 根據權利要求4所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于步驟③中，所述 壯苗培養基中有機附加物為質量濃度為〇. 5%的椰子乳或1. 5% 土豆泥或1. 5%胡蘿卜泥。
6. 根據權利要求1或2所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于步驟④增殖 培養中，所述的增殖培養基中包含〇. 5mg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA和質量濃度為2. 5~3. 0% 的鹿糖，pH值為5. 6?6. 0。
【文檔編號】A01H4/00GK104221852SQ201310229432
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月9日 優先權日:2013年6月9日
【發明者】張影波, 于福來, 李偉, 龐玉新, 谷陟欣, 黃勝, 徐向平, 王丹, 官玲亮, 袁莉 申請人:九芝堂股份有限公司, 海南九芝堂藥業有限公司