黃山貢菊莖尖組織培養的方法
【專利摘要】本發明涉及一種黃山貢菊莖尖組織培養的方法，包括以下步驟：培養基的配制，外植體的選取與消毒、莖尖剝離、莖尖誘導培養、繼代增殖培養、生根誘導培養、組培苗馴化與栽培。基本培養基選用MS培養基，0.4～0.6%的瓊脂，3%的蔗糖，PH值為5.6～5.8，溫度25℃±2；莖尖啟動誘導培養基為MS+6-BA1.0～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L；不定芽繼代增殖培養基為MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.01～0.1mg/L；試管內生根培養基為2/1MS+NAA0.5～1.5mg/L；試管外生根基質為蛭石和珍珠巖等量混合而成。本發明的優點：建立黃山貢菊組織培養快繁技術體系，試管黃山貢菊不帶病，質量好，試管黃山貢菊培養條件可控，可周年工廠化生產，種苗繁殖速度快，周期短，繁殖系數高；健壯均勻，移栽成活率高，可達90%以上，適合規模化生產。
【專利說明】黃山貢菊莖尖組織培養的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及黃山貢菊莖尖組織培養的方法，具體來說是利用組織培養技術來繁殖黃山貢菊的方法。
【背景技術】
[0002]黃山貢菊iPendranthema morifolium PamatO，屬于菊科多年生草本植物，分布在黃山周圍的一些地區，莖嫩綠色，直立單株，單葉互生，卵圓至披針形，淺裂，頭狀花頂上，花色多樣，花蒂嫩綠，質柔軟，氣味清香，均勻不散朵。是具有地方特色名貴中藥材，在中醫臨床治療上有疏風清熱的功效，可用于內熱感冒、頭昏目眩等諸多癥，，對動脈硬化、血壓偏高及動脈硬化等癥也有顯著功效，不僅可以藥用而且可以作為高級飲料佳品，可以泡茶、泡酒，常飲者不僅可以排除體內的毒素，有美容的功效聞名中外，是全國四大名菊之一，深受國內外廣大客戶的青睞。
[0003]黃山貢菊由于長期利用無性繁殖方式進行育苗，不僅質量差，速度慢，而且會使貢菊苗木體內的病毒數量日益增多，導致其發生嚴重病蟲害，生產中大量使用農藥防治，污染嚴重，農藥的殘留量大，造成商品品質和產量都大幅度降低，嚴重影響到了黃山貢菊的經濟價值和產業發展。因此，通過組組織培養的方法快速繁殖黃山貢菊，可以將植物體內的一些病毒消除，提高黃山貢菊的質量和產量。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對黃山貢菊長期利用無性繁殖的方式進行繁殖，導致貢菊苗木帶病和種性退化問題，提供一種組織培養快速繁殖黃山貢菊的方法，提高黃山貢菊的品質和產量，用這種方法培養的貢菊生根率達95%以，成活率在95%以上，從而實現了本發明目的。
[0005]本發明黃山貢菊莖尖組織培養的方法，包括以下步驟:
(1)外植體的消毒處理:剪取生長健壯無病蟲害的黃山貢菊頂芽作為組織培養外植體，放入加少許洗衣粉的溶液浸泡10 min，用自來水沖洗Ih左右，在超凈工作臺上用70%的酒精中浸沒15 S，用無菌水沖洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加兩滴吐溫滅菌4 min，最后用無菌水沖洗4~5遍備用。
[0006](2)莖尖誘導分化:將消毒過的黃山貢菊頂芽，用鑷子和解剖刀剝去嫩葉，露出生長錐，用刀尖切下0.3~0.5mm的生長點，并帶2~3對葉原基，立即接種到啟動培養基中，所術啟動培養基以MS基本培養基，添加6-芐氨基嘌呤(6-ΒΑ)1.0~2.0mg/L、奈乙酸(NAA)
0.1~0.5mg/L、0.4~0.6%的瓊脂，3%的蔗糖，PH值為5.6~5.8，溫度25°C ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX，直至萌發形成黃山貢菊小芽。
[0007](3)繼代增殖:將莖尖誘導的再生小植株轉接到增殖培養基中進行繼代增殖培養，所術增殖培養基為MS基本培養基，添加6-芐氨基嘌呤(6-ΒΑ)1.0~3.0mg/L、奈乙酸(NAA)0.01~0.1mg/L、0.4~0.6%的瓊脂，3%的蔗糖，PH值為5.6~5.8，溫度25°C ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX進行不定芽的增殖。
[0008](4)試管內生根:當步驟(3)的芽高長到瓶口時，將苗剪成莖段接種到生根培養基中，所述的培養基為1/2MS基本培養基，添加奈乙酸(NAA)0.5~1.5mg/L、0.4~0.6%的瓊月旨，3%的蔗糖，PH值為5.6~5.8。在溫度為25°C ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX培養至正常生根。
[0009](5)試管外煉苗:當步驟(4)的生根試管苗長至4~5cm時，在自然光煉苗3~4天，洗凈根部培養基，移至蛭石、珍珠巖和泥碳土等量混合而成的基質中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其濕度為85%~95%，遮蔭60%~70%，保溫20~30°C培養。
[0010](6)試管外生根:當步驟(3)的芽高長到瓶口時，將其剪成莖段，用生根粉處理后，扦插到蛭石和珍珠巖等量混合而成的基質中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其濕度為85%~95%，遮蔭60%~70%，保溫20~30°C培養，10 d左右開始生根，成活率達90%以上。
[0011]步驟(1)在外植體消毒處理中，用70%的酒精中浸沒15 S，添加兩滴吐溫(表面活性劑)，提高殺菌的效果，提高黃山貢菊莖尖成活率5~10百分點。
[0012]步驟(2)芽誘導培養中，15~20 d能在外植體上形成不定芽。
[0013]步驟(3)中的一個繼代周期為25~30d，每個繼代增殖周期后的增殖倍數為10~20倍，繼代10代后仍能保持增殖率。
[0014]步驟(4)所述的莖段為2~3cm，培養的時間一般是15~20 d，每株苗有根數5~15條，在1/2MS基本培養基中添加奈乙酸生根快、生根整齊且粗壯，不添加奈乙酸生根快慢不一且細弱。
[0015]步驟(5)中移栽7~15 d即可移至大田栽培。
[0016]步驟(6)所述莖段4~5cm,用0.5~0.8g/L的生根粉速蘸5 s,基質在扦插之前用0.3%~0.5%高錳酸鉀消毒，培養20~25 d即可移至大田栽培，每株苗有根數10~15條，和試管內長出根的數量、質量相當。試管外生根由于減少了一個無菌操作步驟，因而可降低成本。
[0017]本發明通過組織培養進行試管黃山貢菊的繁殖，具有以下優點:
1，繁殖系數高，繁殖周期短，且整個繁殖均在人工控制的條件下進行，不受外界環境的影響，可以周年進行生產，一年可可繁殖7~9代，而黃山貢菊常規生產用苗一年只可繁殖I~2代。本發明極大提高了黃山貢菊繁殖速度，有利于優新黃山貢菊品種的推廣應用。
[0018]2，試管黃山貢菊苗不帶病，解決了黃山貢菊常規用苗易帶病的問題，通過莖尖組織快繁脫去黃山貢菊苗各種病毒，恢復貢菊的優良品質，提高產量。田間生長抗病能力強，表現為葉色濃綠，莖桿粗壯，生長勢強，開花時間比常規苗提前10天左右、且花朵大、層次多，色澤潔白，整株無病蟲害、無枯葉。經測算，預計干花畝產達到90kg，比常規苗增產40%左右，各項指標均優于常規苗。
[0019]綜上所述，本發明為黃山貢菊產業的發展，為滿足優質種苗市場的需要，提供了一種快速、方便、有效的繁殖方法。
[0020]3、黃山貢菊現有的育苗方式是農戶各自用扦插、分株等無性繁殖方式，速度慢，苗木質量標準不能統一，不能滿足生產需求，本發明可以進行黃山貢菊的規模化、工廠化育苗，為市場提供規格整齊一致的優質種苗。
[0021]4、生產中黃山貢菊長期利用無性繁殖方式進行育苗，會使貢菊苗木體內的病毒數量日益增多，導致其發生嚴重病蟲害，生產中大量使用農藥防治，污染嚴重，且農藥的殘留量大，造成商品品質和產量都大幅度降低，嚴重影響到了黃山貢菊的產業發展。本發明用黃山貢菊莖尖組織培養生產出脫毒的黃山貢菊種苗，解決了品質退化問題。
【具體實施方式】
[0022]以下的實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
[0023]實施例1:
在生長季節選取生長健壯無病蟲害的黃山貢菊頂芽，放入加少許洗衣粉的溶液浸泡10min,用自來水沖洗Ih左右，在超凈工作臺上用70%的酒精中浸沒15 S，用無菌水沖洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加兩滴吐溫滅菌4min，最后用無菌水沖洗4~5遍。將消毒過的黃山貢菊頂芽，用鑷子和解剖刀剝去嫩葉，露出生長錐，用刀尖切下0.5mm的生長點，接種到誘導培養基中(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)，PH值為5.8，溫度25V ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX，進行培養至長出小芽，25天后將誘導出貢菊小芽，轉接到增殖培養基中(MS+ 6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)PH值為5.8，溫度25°C ±2，每天光照12h，光照強度為2000~3000LX進行不定芽的增殖，25d為I個繼代增殖周期，I個繼代增殖周期后的增殖倍數為10倍。當芽高長到6~8cm時，將苗剪成2~3cm莖段接種到生根培養基中(l/2MS+NAAlmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)，PH值為5.8，在溫度為25°C ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX培養至正常生根。培養15 d生根時生根率為95%以上，每株苗有根數5~10條。當生根試管苗長至4~5cm時，在自然光煉苗3~4 d，洗凈根部培養基，移至蛭石、珍珠巖和泥碳土等量混合而成的基質中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其濕度為85%~95%，遮蔭60%~70%，保溫20~30°C培養，成活率達90%以上，移栽后15 d即可移至大田栽培。
[0024]實施例2:
在生長季節選取生長健壯無病蟲害的黃山貢菊頂芽，放入加少許洗衣粉的溶液浸泡10min,用自來水沖洗Ih左右，在超凈工作臺上用70%的酒精中浸沒15 S，用無菌水沖洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加兩滴吐溫滅菌4min，最后用無菌水沖洗4~5遍。將消毒過的黃山貢菊頂芽，用鑷子和解剖刀剝去嫩葉，露出生長錐，用刀尖切下0.5mm的生長點，接種到誘導培養基中(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)，PH值為5.8，溫度25V ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX，進行培養至長出小芽，25天后將誘導出貢菊小芽，轉接到增殖培養基中(MS+ 6-BA2.0mg/L+NAA0.0 lmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)PH值為5.8，溫度25°C ±2，每天光照12h，光照強度為2000~3000LX進行不定芽的增殖，25d為I個繼代增殖周期，I個繼代增殖周期后的增殖倍數為8倍。當芽高長到6~8cm時，將苗剪成2~3cm莖段接種到生根培養基中(l/2MS+NAAlmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)，PH值為5.8，在溫度為25°C ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX培養至正常生根。培養15 d生根時生根率為95%以上，每株苗有根數5~10條。當生根試管苗長至4~5cm時，在自然光煉苗3~4 d，洗凈根部培養基，移至蛭石、珍珠巖和泥碳土等量混合而成的基質中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其濕度為85%~95%，遮蔭60%~70%，保溫20~30°C培養，成活率達90%以上，移栽后15 d即可移至大田栽培。
[0025]實施例3:在生長季節選取生長健壯無病蟲害的黃山貢菊頂芽，放入加少許洗衣粉的溶液浸泡10min,用自來水沖洗Ih左右，在超凈工作臺上用70%的酒精中浸沒15 S，用無菌水沖洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加兩滴吐溫滅菌4min，最后用無菌水沖洗4~5遍。將消毒過的黃山貢菊頂芽，用鑷子和解剖刀剝去嫩葉，露出生長錐，用刀尖切下0.5mm的生長點，接種到誘導培養基中(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)，PH值為5.8，溫度25V ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX，進行培養至長出小芽，25天后將誘導出貢菊小芽，轉接到增殖培養基中(MS+ 6-BA3.0mg/L+NAA0.0 lmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)PH值為5.8，溫度25 V ±2，每天光照12h，光照強度為2000~3000LX進行不定芽的增殖，30d為I個繼代增殖周期，I個繼代增殖周期后的增殖倍數為15倍。當芽高長到6~8cm時，將苗剪成2~3cm莖段接種到生根培養基中(l/2MS+NAAlmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)，PH值為5.8，在溫度為25°C ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX培養至正常生根。培養20天生根時生根率為95%以上，每株苗有根數10~15條。當生根試管苗長至4~5cm時，在自然光煉苗3~4 d，洗凈根部培養基，移至蛭石、珍珠巖和泥碳土等量混合而成的基質中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其濕度為85%~95%，遮蔭60%~70%，保溫20~30°C培養，成活率達90%以上，移栽后15 d即可移至大田栽培 。
[0026]實施例4:
在生長季節選取生長健壯無病蟲害的黃山貢菊頂芽，放入加少許洗衣粉的溶液浸泡10min,用自來水沖洗Ih左右，在超凈工作臺上用70%的酒精中浸沒15 S，用無菌水沖洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加兩滴吐溫滅菌4min，最后用無菌水沖洗4~5遍。將消毒過的黃山貢菊頂芽，用鑷子和解剖刀剝去嫩葉，露出生長錐，用刀尖切下0.5mm的生長點，接種到誘導培養基中(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)，PH值為5.8，溫度25V ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX，進行培養至長出小芽，25天后將誘導出貢菊小芽，轉接到增殖培養基中(MS+ 6-BA3.0mg/L+NAA0.0 lmg/L+0.5%瓊脂+3%蔗糖)PH值為5.8，溫度25 V ±2，每天光照12h，光照強度為2000~3000LX進行不定芽的增殖，30天為I個繼代增殖周期，I個繼代增殖周期后的增殖倍數為15倍。當芽高長到8~IOcm時，
將其剪成3~4m的莖段，用0.5~0.8g/L的生根粉速蘸5 S，扦插到蛭石和珍珠巖等量混合而成的基質中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其濕度為85%~95%，遮蔭60%~70%，保溫20~30°C培養，10 d左右開始生根，每株苗有根數10~15條，成活率為90%以上，培養20 d即可移至大田栽培。
【權利要求】
1.一種黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，對外植體進行消毒處理； 步驟二，將消毒處理后的莖尖外植體進行誘導培養，獲得不定芽； 步驟三，將誘導培養出不定芽進行繼代增殖培養； 步驟四，將增殖培養后的不定芽進行試管內生根培養，試管外煉苗，得到再生植株； 步驟五，將增殖培養后的不定芽進行試管外生根培養，得到再生植株。
2.根據權利要求1所述的黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于，步驟一中，所述消毒處理包括以下步驟:剪取生長健壯無病蟲害的黃山貢菊頂芽作為組織培養外植體，放入飽和洗衣粉的溶液中浸泡10 min左右，用自來水沖洗Ih左右，在超凈工作臺上用濃度為70%左右的酒精中浸沒15 s左右，用無菌水沖洗2遍，再用濃度為0.1%左右的氯化汞溶液加兩滴吐溫滅菌4 min,最后用無菌水沖洗4-5遍。
3.根據權利要求1所述的黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于，在進行步驟二前，先將所述將消毒過的黃山貢菊頂芽外植體用鑷子和解剖刀剝去嫩葉，露出生長錐，用刀尖切下0.3-0.5mm的生長點，并帶2_3對葉原基，立即接種到誘導培養基中。
4.根據權利要求1所述的黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于，步驟二中，所述誘導培養需要使用誘導培養基，其原料配比為:在MS基本培養基中添加6-芐氨基嘌呤1.0~2.0mg/L、奈乙酸0.1~0.5mg/L、0.4~0.6%的瓊脂，3%左右的蔗糖，PH值為5.6~5.8，溫度25°C ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX，時間為20~25 d。
5.根據權利要求1所述的黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于，步驟三中，所述的增殖培養需要使用增殖培養基，其原料配比為:在MS基本培養基中添加6-芐氨基嘌呤(6-ΒΑ)1.0 ~3.0mg/L、奈乙酸(NAA)0.01 ~0.1mg/L、0.4 ~0.6% 的瓊脂，3% 左右的蔗糖，PH值為5.6~5.8，溫度25°C ±2，每天光照12h左右，光照強度為1500~2000LX，時間為25 ~30 do
6.根據權利要求1所述的黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于，步驟四中，所述的生根培養需要使用生根培養基，其原料配比為:在1/2MS基本培養基中添加奈乙酸(NAA)0.5~1.5mg/L、0.4~0.6%的瓊脂，3%的蔗糖，PH值為5.6~5.8，在溫度為25°C ±2，每天光照12h，光照強度為1500~2000LX，時間為15~20 d。
7.根據權利要求1所述的黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于，步驟四中，所述試管苗外煉苗:在蛭石、珍珠巖和泥碳土等量混合而成的基質中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其濕度為85%~95%，遮蔭60%~70%，保溫20~30°C培養，時間為7~15 d。
8.根據權利要求1所述的黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于，步驟五中，所述試管外生根培養的方法為:當貢菊芽長到8~IOcm時，將其剪成莖段，用生根粉處理后，扦插到基質中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其濕度為85%~95%，遮蔭60%~70%，保溫20~30°C培養，時間為20~25 do
9.根據權利要求7所述的黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于，步驟五中，所述莖段為4~5cm， ABT生根粉濃度為0.5~0.8g/L，處理時間為5 S，基質為蛭石和珍珠巖等量混合而成，基質在扦插之前用濃度為0.3%~0.5%的高錳酸鉀溶液消毒。
10.根據權利要求1所述的黃山貢菊莖尖組織培養的方法，其特征在于: 基本培養基選用MS培養基，0.4~0.6%的瓊脂，3%的蔗糖，PH值為5.6~5.8，溫度， 25°C ±2 ;莖尖啟動誘導培養基為MS+6-BA1.0~2.0mg/L+NAA0.1~0.5mg/L ;不定芽繼代增殖培養基為MS+6-BA1.0~3.0mg/L+NAA0.01~0.lmg/L ;試管內生根培養基為2/1MS+ΝΑΑ0.5~1.5mg/L ;試管外生根基質為蛭石和珍珠巖等量混合而成。
【文檔編號】A01H4/00GK103563746SQ201310494252
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月21日 優先權日:2013年10月21日
【發明者】陳黎, 孟承安, 萬志兵, 蘇勝榮, 李燕 申請人:黃山學院